富含不饱和脂肪酸蛋黄磷脂酰胆碱的提取与分子结构分析

朱 帅，黄梦玲，樊 俐，杨瑞鹏，张 敏，刘 云

专题报道（一）

富含不饱和脂肪酸蛋黄磷脂酰胆碱的提取与分子结构分析

朱 帅1，黄梦玲1，樊 俐1，杨瑞鹏2，张 敏2，刘 云1

（1. 北京化工大学 生命科学与技术学院，北京 100029；2. 蜜儿乐儿乳业（上海）有限公司，上海 200335）

磷脂酰胆碱（PC）是鸡蛋蛋黄中的主要活性因子，为人体提供营养和保护。采用响应面法优化乙醇提取富含不饱和脂肪酸蛋黄PC工艺参数，经薄层色谱初步纯化后，气相-质谱（GC-MS）联用仪和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）分析PC脂肪酸组成和分子结构。结果表明，乙醇提取蛋黄PC最适工艺参数为：料液比（v∶v）为1∶16（g/mL），乙醇浓度93.77%，提取温度42.98 ℃。在此条件下，PC提取率24.38%，纯度61.19%。PC中主要脂肪酸为油酸（40.66%）、软脂酸（16.35%）、亚油酸（13.06%）、硬脂酸（7.27%）和棕榈油酸（5.19%），以及少量花生四稀酸（0.48%）和二十二碳六烯酸（0.37%），共鉴定出9种蛋黄PC分子结构，即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14- PC和 16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。

蛋黄磷脂酰胆碱；乙醇提取；脂肪酸组成；分子结构

蛋黄卵磷脂是从鸡蛋黄中提取得到的一种天然磷脂混合物，占鸡蛋黄干重8%~10%[1-2]，主要分为磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI），及少量溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和鞘磷脂（SM），其中PC含量超过70%[3-5]。研究表明，卵磷脂具有调节血脂[6]、提高记忆力[7]和抗氧化等诸多生理活性[8]。Souza等报道了卵磷脂作为饲料添加剂，可以降低动物胆固醇含量[9]，Lesnierowsk 等报道了蛋黄卵磷脂在保健食品领域的应用[10]。此外，卵磷脂还广泛应用于医药和化妆品等行业[11-14]。

目前，卵磷脂提取方法包括有机溶剂萃取 法[15-16]、超声辅助提取法[17-18]和超临界萃取 法[19-20]。张椿等采用超声微波辅助法提取鸡蛋卵磷脂，得率为7.5%[2]。范劲松等利用超临界CO2提取蛋黄卵磷脂，PC得率为17.5%[21]。然而，不同提取方法所得蛋黄PC分子结构种类是不一样的。陈晋等采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）与气相质谱（GC-MS）联用技术鉴定出9种蛋黄PC分子结构[22]，Ali等运用UPLC-Q-TOF/MS鉴定出20种蛋黄PC分子结构[23]。

本文以鸡蛋蛋黄粉为原料，采用丙酮脱油、乙醇溶剂提取PC，响应面优化提取工艺参数，所得PC提取物经薄层色谱纯化，利用GC-MS和MALDI-TOF/MS分析PC脂肪酸组成和分子结构，为蛋黄卵磷脂产品开发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋：蜜儿乐儿乳业（上海）有限公司；蛋黄磷脂酰胆碱（PC）标准品：上海源叶生物科技有限公司；硅胶板：青岛海洋化工厂；丙酮、乙醇均为国产分析纯。

FD-1A-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；DF-101S磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；UV-756紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器有限公司；QP2010 Ultra气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；Autoflex III Smartbeam MAIDI-TOF/MS仪：德国布鲁克公司。

1.2 PC提取与含量测定

1.2.1 工艺流程

图1 蛋黄卵磷脂提取工艺流程

1.2.2 丙酮脱脂

准确称取一定质量的干燥蛋黄粉，放入烧杯中，然后加入丙酮，蛋黄粉/丙酮重量体积比（g/mL）为1∶4、1∶7、1∶10、1∶13和1∶16，磁力搅拌进行脱脂处理，脱脂时间为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h。脱脂完成后，抽滤，将滤饼置入恒温干燥箱中，40 ℃干燥1.5 h，得丙酮不溶物，计算得率。以丙酮不溶物得率大小，考察丙酮脱脂效果。每个实验点重复3次，取平均值。

1.2.3 乙醇提取PC的单因素实验

以上述丙酮脱脂后的蛋黄粉为原料，考察了乙醇法提取PC的4个主要影响因素：提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h）、料液比（1∶4、1∶7、1∶10、1∶13和1∶16 g/mL）、乙醇浓度（60%、70%、80%、90%和100%）和提取温度（20、30、40、50和60 ℃）。每个实验点均重复3次，取平均值。

1.2.4 乙醇提取PC的响应面优化

单因素实验结果表明，料液比、乙醇浓度和温度对乙醇法提取PC效果影响最大。为此，采用响应面Box-Benhken实验，设计了三因素三水平，以PC提取率为因变量，优化上述3个因素，实验设计见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.2.5 分光光度法测定PC含量与PC提取率计算

乙醇提取物中PC含量的测定采用分光光度法进行[17]。首先，配制浓度为10 mg/mL的蛋黄磷脂酰胆碱标准品母液，用乙醇进行适当稀释。全波长扫描标准品稀释溶液，PC最大吸收峰为210 nm。然后，以浓度为0、10、20、30、40和50 μg/mL标准溶液，210 nm测定吸光值，以PC浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线（= 0.007 6– 0.001 2，2= 0.997 3）。每一个样品做3次平行，取平均值。最后，在210 nm条件下测定PC样品的吸光值，通过标准曲线计算样品中PC含量，同时，以下公式计算PC提取率：

式中：Y为PC提取率（%）；为样品中PC浓度（μg/mL）；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；M为脱脂蛋黄粉质量（mg）。

1.3 PC结构中的脂肪酸组成与分子结构分析

1.3.1 薄层色谱纯化

将PC提取物和标准品分别用无水乙醇溶解，用毛细管吸取样液后，点在距薄层板底部1 cm处，待干燥后，将薄层板放入装有展开剂（氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4，v/v/v）的层析缸中展开，然后用碘蒸气显色进行观察[24]。

1.3.2 GC-MS分析PC脂肪酸组成

甲酯化[25]：准确称取30 mg样品放入具塞试管中，加入12%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在80 ℃水浴下反应10 min，冷却后加入0.05 mol/L氢氧化钾甲醇溶液2 mL，再在80 ℃水浴下反应 10 min，冷却后加入5 mL饱和氯化钠溶液清洗，最后，加入2 mL正己烷溶液提取，吸取上层液，加入少量无水硫酸钠吸收水分，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，装瓶用于GC-MS分析。

GC-MS分析：色谱柱：DB-5MS UI（Agilent，J&W Scientific，30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度为250 ℃，分流比为10∶1，载气为高纯氦气，流速为1 mL/min。升温程序：100 ℃保持 2 min，以6 ℃/min升至320 ℃保持10 min。离子源温度为220 ℃，接口温度为280 ℃，溶剂峰切除时间3 min，扫描范围：45~500 m/z。

1.3.3 MALDI-TOF/MS分析PC分子结构

将1 μL基质溶液点到板子上挥发干后，再将1 μL待测溶液点到基质上，挥发干溶剂后进行检测。仪器：配备337 nm氮分子激光器的MAIDI- TOF/MS（BrukerAutoflex III），加速电压为20 kV，基质为2, 5-二羟基苯甲酸（2,5-DHB），发射模式为正离子模式，扫描范围：300~1 000 m/z。

1.4 数据统计与分析

利用Design expert 8.0软件处理和分析实验数据。

2 结果与讨论

2.1 丙酮对蛋黄粉脱脂效果的影响

分别考察蛋黄粉/丙酮料液质量体积比和脱脂时间对脱脂效果的影响，结果见图2。由图2a可知，总体趋势为料液比增大，脱脂效果越好，即丙酮不溶物得率下降。当料液比1∶10时，丙酮不溶物得率为55.49%。进一步加大料液比，丙酮不溶物得率趋于平缓。为此，丙酮脱脂时，料液比选择为1∶10。由图2b可以看出，随着延长脱脂时间，丙酮不溶物得率变化不大，结果表明，脱脂时间对丙酮脱脂效果的影响较小。考虑到1.5 h时脱脂效果较好，最终选择脱脂时间为1.5 h。

2.2 乙醇提取PC的单因素实验

以上述脱脂蛋黄粉为原料，探讨乙醇法提取蛋黄PC的工艺技术，分别考察提取时间、料液比（质量体积比）、乙醇浓度和提取温度对PC得率的影响，结果见图3。

图2 丙酮脱脂效果的影响

图3 乙醇提取脱脂蛋黄粉PC的影响因素分析

由图3a可知，延长提取时间可适当提升PC产品得率，在1 h时达到最大值16.95%，之后PC提取率略微下降并趋于平缓。这说明乙醇提取1 h，绝大部分PC已经溶解在乙醇中，继续延长提取时间，PC提取率没有变化，反而造成时间的浪费，增加提取能耗和成本。因此，提取时间选择1 h。

由图3b可以看出，料液比对PC提取率影响较明显，增大料液比，PC提取率明显增加。较低料液比（≤1∶6），蛋黄粉与乙醇溶液不能充分混匀，且易使乙醇溶解PC达到饱和状态，导致PC提取率偏低。提高料液比，蛋黄粉与乙醇溶液接触充分，PC提取率随之增加。是当料液比为1∶13，PC提取率逐渐趋于平稳，提取率稳定在15.56%。因此，料液比选取1∶13。

图3c显示，乙醇浓度明显影响PC提取率。乙醇浓度为60%时，PC提取率低（约3%），增加乙醇浓度，PC提取率显著增加。乙醇浓度为90%时，PC提取率达到最大值22.93%，进一步增加乙醇浓度，PC提取率反而开始下降，原因是乙醇浓度增加，其它醇溶性的杂质也随之提取出来。因此，乙醇浓度选取90%。

图3d显示，提取温度≤40 ℃时，PC提取率随提取温度升高而增加，原因是温度升高加速了分子运动,可以加速传质过程。提取温度为40 ℃时，PC提取率最高，为23.76%。然而，继续提高提取温度，PC提取率呈现下降趋势。原因可能是PC热敏性所导致，高温下PC不稳定且易发生氧化作用，致使PC提取率降低。因此，提取温度选取为40 ℃。

2.3 乙醇提取PC工艺参数的响应面优化

基于单因素实验结果，根据表1响应面实验设计，优化乙醇提取PC的主要工艺参数，结果见表2。

使用Design expert 8.0软件，对表2中的实验数据进行回归拟合分析，PC得率（）的回归方程为：

=0.25+0.006 6+0.030+0.013+0.001 7– 0.001 1–0.011–0.0202–0.0382–0.00132

对表2数据进行方差分析和显著性检验，结果见表3。由表3可知，模型校正决定系数2Adj为0.961 1，表明模型预测值有96.11%的可信度。模型确定系数2=0.983 0，说明该模型拟合度好，误差小。从表3中还可以看出，回归模型<0.000 1，失拟项值为0.331 2（>0.05），进一步表明模型显著性极好，偏差小。方差分析结果表明，模型一次项，交互项显著影响PC提取率（< 0.05）；一次项、，二次项2、2和2极显著影响PC提取率（< 0.01）；交互项和不显著。由值大小可知，各因素对PC提取率的影响作用贡献大小为：乙醇浓度（）>提取温度（）>料液比（）。

表2 响应面实验设计与结果

表3 回归模型方差分析结果

注：* 表示差异显著（<0.05）；** 表示差异极显著（<0.01）。

根据响应面等高图（如图4）可以直观地获得乙醇提取PC的最佳工艺参数：料液比1∶16 （g∶mL），乙醇浓度93.77%，提取温度42.98 ℃。在此条件下，PC得率预测值为24.38%。考虑实际操作要求，最终确定实验条件为：料液比1∶16（g∶mL），乙醇浓度94%，提取温度43 ℃。为验证该模型的准确性和可重复性，在上述实验条件下进行3组平行实验，PC提取率平均为24.23%，与模型预测值相比，相对误差为0.62%，表明该模型拟合度高，重复性好。

A、B：乙醇浓度和料液比交互作用；C、D：温度和料液比交互作用；E、F：乙醇浓度和温度交互作用

2.4 PC分子结构分析

2.4.1 薄层色谱分离纯化PC

考察3种不同展开剂对PC分离纯化的影响，以PC标准品作对照，结果见图5。由图5中可知，二氯甲烷/甲醇/水作展开剂，无法有效分离纯化PC（如图5A和B）。展开剂为氯仿∶甲醇∶水= 65∶25∶4(v/v/v)，PC和PE可有效分开（如图5C）。分光光度法测定纯化后PC含量，为61.19%，比粗提物PC含量提高近3倍。

A 二氯甲烷∶甲醇∶水=65∶20∶4，v/v/v；B 二氯甲烷∶甲醇∶水=60∶20∶4，v/v/v；C 氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4，v/v/v

2.4.2 GC-MS分析PC脂肪酸组成

分离纯化所得PC甲酯化后，进行GC-MS分析，总离子流图见图6所示，与标准谱库对比，得到7种脂肪酸组成，列举表4中。由此可知，蛋黄PC脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，占总脂肪酸58.91%。主要脂肪酸组成为油酸（40.66%）、软脂酸（16.35%）、亚油酸（13.06%）、硬脂酸（7.27%）和棕榈油酸（5.19%）。同时，蛋黄PC中还含有少量的花生四稀酸（0.48%）和二十二碳六烯酸（0.37%）。

图6 GC-MS总离子流色谱图

2.4.3 MALDI-TOF/MS分析PC分子结构

MALDI-TOF/MS结合GC-MS是分析蛋黄PC分子结构的有效方法[26]。在正离子模式下得到相应的质谱图，截取m/z为750~850进行分析，结果见图7。质谱结果表明，从蛋黄中分离的PC具有7种不同类型的脂肪酸和9种分子结构，这和Chen等的研究结果一致[27]。结合GC-MS脂肪酸种类及双键所在位置，9种蛋黄PC的分子结构如图8所示，即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/ 18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14-PC和16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。由此可见，蛋黄PC中含有较高的不饱和脂肪酸，包括棕榈油酸、亚油酸、油酸、花生四稀酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA）,这些不饱和脂肪酸与人体健康息息相关。

表4 蛋黄PC脂肪酸组成

图7 MALDI-TOF质谱图

图8 蛋黄PC的分子结构

3 结论

采用丙酮脱脂、乙醇提取的方法提取蛋黄粉中的PC，获得最佳提取工艺参数：料液比1∶16 （g/mL），乙醇浓度93.77%，提取温度42.98 ℃。在此条件下，PC提取率为24.23%，与模型预测值（24.38%）相比，相对误差为0.62%。PC粗提物经薄层色谱分离纯化、MALDI-TOF/MS联用GC-MS分析，得到9种蛋黄PC的分子结构，即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/ 18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC,18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14-PC和16:0/ 22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。

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备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。

Egg yolk phosphatidylcholine enrichment in unsaturation fatty acids: Extraction and molecular structure

ZHU Shuai1, HUANG Meng-ling1, FAN Li1, YANG Rui-peng2, ZHANG Min2, LIU Yun1

(1. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China; 2. Mille Dairy (Shanghai) Co. Ltd, Shanghai 200335, China)

Egg yolk is rich in phosphatidylcholine (PC), which is the keyphospholipid component providing nourishment and protection for our body. We herein optimize the ethanol extraction parameters for PC in egg yolk using response surface methodology. After preliminary purification through thin-layer chromatography, PCfatty acid compositions are identified by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS), and their molecular structure are also elucidated by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectroscope (MALDI- TOF/MS). Results show that the optimal parameters for PC extraction from egg yolk are: weight/volume ratio of egg yolk to ethanol of 1∶16 (g:mL), ethanol concentration of 93.77%, extraction temperature of 42.98 ℃. Under the optimal conditions, 24.38% of PC yield is obtained, and PC content is approx.61.19% detected by UV-Vis spectroscopy. GC-MS analysis reveals that the main fatty acids of PC are oleic acid (40.66%), palmitic acid (16.35%), linoleic acid (13.06%), stearic acid (7.27%), palmitoleic acid (5.19%) and a small amount ofarachidonic acid (0.48%) and docosahexaenoic acid (0.37%). Nine kinds of PC molecular structures are elucidated from MALDI-TOF/MS profiles, namely, 16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC,18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14- PC and 16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC.

egg yolk; phosphatidylcholine (pc); ethanol extraction; fatty acid composition; molecular structure

TS201.1

A

1007-7561(2020)03-0010-08

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.002

2020-03-02

企业委托项目（H2019167）

朱帅，1997年出生，男，硕士生，研究方向为卵磷脂产品开发.

刘云（ORCID：0000-0002-7521-3831），男，教授，博导，研究方向为功能食品和生物资源利用, E-mail: liuyun@meil.buet.edu.cn

2020-04-17 11:08:13

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3863.TS.20200417.1028.004.html