热辅助解吸-介质阻挡放电离子化质谱快速检测磺胺类药物

叶 倩, 朱秋梦, 周 峰, 吴剑平, 严 凤, 赵 鹏*, 闻路红,3

(1. 宁波大学, 宁波高等技术研究院, 浙江 宁波 315211; 2. 上海市兽药饲料检测所, 上海 201103; 3. 广州市华粤行仪器有限公司, 广东 广州 511400)

抗菌类药物在预防和诊治动物疾病、保障产出等方面效果显著[1]。磺胺类药物是以对氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物,它具有抗菌谱广、稳定性好、效价高、毒性小且易吸收等特点,被广泛应用于家禽养殖行业,尤其是肉鸡养殖业中。磺胺类药物会通过在家禽产品中的残留进入人体,经常食用会产生累积,从而导致过敏、细菌耐药性增强、致癌等[2]。

目前,饲料及家禽肉制品中磺胺类药物的检测方法多采用液相色谱-串联质谱法[3],该方法需经过复杂的前处理过程,效率低,无法满足大样本量检测,因此,建立一种高效、快速、准确的筛查方法十分必要,可作为液相色谱-串联质谱的补充来提高样品检测通量。现有的快速筛查方法主要有酶联免疫吸附法[4]、胶体金免疫层析法[5]、生物传感器[6]等,但以上快速筛查方法均会受到严重的生物基质干扰,且在不同基质下结果差异极大,有较高的误报率,实际应用过程中并不能够完全满足产业的需求,导致不能很好地支撑磺胺类药物快速、准确的筛查工作。

敞开式质谱离子源技术是一种直接分析样品或样品表面的新型质谱分析技术[7],凭借快速、原位、实时离子化样品等优势,被广泛应用于样品快速筛查、真伪鉴定等领域[8]。介质阻挡放电(dielectric barrier discharge, DBD),又称无声放电[9],其放电原理是用绝缘介质将放电电极覆盖,通过施加高压,使得填充在电极间的工作气体被击穿,发生介质阻挡放电[10]。其产生的等离子体通过Penning离子化等一系列分子-离子反应,与气相中的样品分子进行能量和电荷交换,生成样品准分子离子,而不会受到生物大分子和无机盐的干扰[11]。现已通过成果转化研制出商业化的介质阻挡放电离子源(DBDI)[12]。DBDI能够在短时间内实现样品的离子化,而且不受样品形态干扰;还可与各类质谱仪联用;所得的质谱图背景噪声低,便于后续分析[13],可应用于磺胺类药物的快速检测。

本工作基于热辅助解吸(HAD)平台,开发了不同的应用方法来提升样品的热解吸效率,实现难挥发物质的电离,促进样品更有效地离子化,并且可实现快速更换,提高检测效率。检测了磺胺类药物的标准溶液,并以鸡肉、饲料中模拟添加样本进行应用研究,证明了HAD-DBDI可耐受更强的基质干扰,能够将样品从复杂基质中快速分离出来进行检测,提升了磺胺类药物的检出能力,是一种良好的磺胺类药物检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DBDI机箱、DBDI-100离子源、HAD加热平台(宁波华仪宁创智能科技有限公司); ThermoFinnigan LTQ-MS质谱仪(Thermo公司);微电极玻璃毛细管(B10024F,外径1 mm,内径0.59 mm,长度100 mm,武汉微探科学仪器有限公司); HICO21离心机(生工生物工程股份有限公司); VORTEX-5涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。YP-30T压片机(天津市金孚伦科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

称取5.0 g粉碎鸡肉样品(磺胺吡啶含量为200 μg/kg)于50 mL的离心管中,加入5 mL的5%甲酸乙腈,手动振摇1 min,加入WondaPak QuEChERS多兽残专用提取包,手动振摇1 min, 10 ℃下 以8 000 r/min 离心5 min,取1 mL上清液转移至WondaPak QuEChERS多兽残专用净化包中,涡旋混合1 min, 以12 000 r/min 离心2 min,取上清液,过0.22 μm微孔滤膜,收集,于4 ℃避光保存。

1.2.2 仪器参数

HAD-DBDI-MS平台示意图见图1。

图 1 HAD-DBDI-MS平台示意图Fig. 1 Schematic of heat assisted desorption-dielectric barrier discharge ionization mass spectrometry (HAD-DBDI-MS) platform

DBDI检测离子源条件:DBDI水平放置,向MS喷射,DBDI和MS进样口的距离为3.0 cm,等离子束对准质谱进样口中心偏下约2～3 mm处。质谱条件:正离子模式,离子传输管温度275 ℃、管状透镜电压120 V、毛细管电压20 V。二级质谱条件:母离子隔离宽度2,碰撞能量30 eV,通过毛细管虹吸进样。

HAD-DBDI检测在DBDI检测的基础上,增加加热平台,加热平台凹槽与等离子束垂直,距离为4 mm,离子传输管温度175 ℃,其余条件与DBDI检测一致。将样品滴加或置于HAD平台凹槽中进样。

加热时甲醇辅助检测:条件与HAD-DBDI检测的条件一致,将样品置于HAD平台凹槽中,同时每间隔5 s滴一滴(10 μL)甲醇辅助挥发。

1.2.3 标准溶液及样品检测

2 结果与讨论

2.1 磺胺类药物标准溶液的DBDI-MS检测

磺胺类药物具有对氨基苯磺酰胺结构,其母体结构、特征官能团见图2,沸点及母离子、子离子信息见表1。

图 2 磺胺类药物的化学结构Fig. 2 Chemical structures of sulfanilamide drugs

表 1 磺胺类药物沸点及母离子、子离子信息Table 1 Boiling points, parent ions and daughter ions of sulfanilamide drugs

5种化合物在ESI正离子模式下的一级质谱均产生准分子离子峰[M+H]+[14],说明磺胺类化合物易与H+结合形成[M+H]+。DBDI的一级质谱也产生准分子离子峰[M+H]+,通过相应的二级质谱扫描,能得到各化合物的碎片离子峰信息,5种磺胺类化合物的二级质谱结果均存在特征离子m/z156 [C6H6NSO2]+、m/z108 [C6H6NO]+和m/z92 [C6H6N]+(见表1)。通过对磺胺类物质的化学结构和串联质谱行为分析发现,磺胺类物质在质谱中主要的碎裂方式为准分子离子[M+H]+中的官能团-SO2-的两端发生碎裂,即苯端和胺端的断裂。裂解发生在胺端时,产生[C6H6NSO2]+、[C6H6NO]+和含有R基团的碎片离子;裂解发生在苯端时,产生[C6H6N]+碎片离子。从裂解规律可以看出,失去R基团也是磺胺类化合物的主要裂解途径之一,除含有R基团的碎片离子各有不同之外,由母体形成的碎片离子都相同,具体裂解见图3。这一裂解特性可以应用于会产生特征离子m/z156 [C6H6NSO2]+、m/z108 [C6H6NO]+和m/z92 [C6H6N]+的磺胺类药物的检测。

图 3 (a)磺胺类药物的裂解示意图及(b)磺胺吡啶的二级质谱图Fig. 3 (a) Cracking schematic diagram of sulfanilamide drugs and (b) secondary mass spectrum of sulfapyridine

2.2 加热温度对HAD-DBDI-MS的影响

DBDI电离是在气相之中由等离子体引发的分子离子反应,样品离子化需先将样品气化,使之成为气相中的游离分子,才能进一步发生离子化反应[15]。对于磺胺类药物,进行DBDI分子离子反应的是气相中的磺胺类分子,磺胺类药物的沸点较高,而DBDI自身能达到的最高温度为250 ℃,与磺胺类药物沸点相差较多,可能会使目标分子解吸不完全,在气相中浓度较低,导致单使用DBDI对磺胺类药物检测能力较弱。引入热辅助解吸平台后,随着温度的进一步升高,热解吸效率升高,使得气相中的目标分子浓度增大,从而提升了信号强度,提升信噪比,降低检出限。以磺胺吡啶为例,温度在200 ℃时的检出限为50 μg/L,之后随着温度的上升,检出限降低,上升至400 ℃时,其检出限为10 μg/L,之后趋于稳定。

2.3 HAD-DBDI-MS用于样品中磺胺的检测

2.3.1 鸡肉中磺胺类药物的测定

使用DBDI-MS和HAD-DBDI-MS两种方法检测鸡肉基质加标样品中的磺胺吡啶(加标水平为200 μg/kg), DBDI-MS检测(温度为175 ℃)的磺胺吡啶子离子m/z156和m/z92的信噪比<3,未能检测到磺胺吡啶;向HAD(温度为400 ℃)上滴加加标样品,再经DBDI-MS检测,磺胺吡啶子离子m/z156的平均信噪比为(238±1,n=7),m/z92的平均信噪比为(5.5±1.0,n=7),可知HAD-DBDI-MS能够有效检测磺胺吡啶(见图4)。

在鸡肉基质中,目标分子被大分子物质包裹结合,以气相形式进入空气中较为困难,且进入空气中的目标分子还会与基质中其他物质产生竞争电离,导致目标分子更难以被电离,因此单使用DBDI无法检测。通过引入HAD,升高温度使大分子物质由于变性等原因降低与目标分子的结合能力,使目标分子更好地游离于溶液中,更容易进入气相,提升气相中目标分子的浓度;且待测组分具有不同的沸点,温度的提升进一步促进目标分子气化,而基质中的无机盐、油脂和蛋白质等物质不易挥发,从而达到目标分子与基质中其他物质分离的目的,使目标分子更易被电离,从而提升磺胺吡啶的检出能力。综上所述,本方法可以在简单样品前处理的条件下对以磺胺吡啶为代表的磺胺类药物进行快速检测,对禽类肉制品的安全食用具有重要的意义。

图 4 DBDI-MS及HAD-DBDI-MS检测鸡肉加标样品中磺胺吡啶的谱图Fig. 4 Spectra of sulfapyridine spiked in chicken matrix by DBDI-MS and HAD-DBDI-MS

2.3.2 饲料中磺胺类药物的测定

饲料中磺胺类药物的添加方式为将磺胺类药物制成预混剂,然后加入饲料并搅拌均匀。这种物理混合方式使磺胺类药物与饲料的连接并不紧密,若采用常用的前处理方法,加入溶剂会使饲料及药品同时溶解,从而引入大量来自饲料内部物质的干扰,增加检出难度。采用表面反射离子化可以避免由于溶解造成的基质干扰,鉴于磺胺类药物气化温度较高,引入HAD辅助目标分子与基质的分离可以获得更好的检出效果。

上述结果中,直接加热法对检测能力的提升并不明显,可能是将饲料压片后,压片内部紧实,药品气化后释放较为困难,除表面的药品外只有少量目标分子能挥发进入气相,使得DBDI无法检测,而继续升高温度会使饲料焦化,产生较为紧实的碳化层,并有固体小颗粒生成,不仅进一步阻止压片内部磺胺类物质的挥发,也会对质谱仪本身产生不利影响。在此基础上尝试了加热时甲醇辅助挥发法,其检测能力大幅提升,可能是由于甲醇的引入使饲料压片内部药品浸润溶出,随甲醇挥发进入气相,气相中样品浓度升高,从而提升信号强度,提高检出能力。

图 5 直接加热法和甲醇辅助加热法检测饲料中磺胺胍的谱图Fig. 5 Spectra of sulfaguanidine in feed by direct heating method and methanol-assisted heating methoda. total ion chromatograms; b. extraction ion chromatograms m/z 156; c. secondary mass spectra.

图 6 直接加热法和甲醇辅助加热法检测饲料中磺胺甲口恶唑的谱图Fig. 6 Spectra of sulfamethoxazole in feed by direct heating method and methanol-assisted heating methoda. total ion chromatograms; b. extraction ion chromatograms m/z 156; c. secondary mass spectra.

3 结论

本文研究了热辅助解吸-介质阻挡放电离子化质谱技术,通过对热辅助解吸平台加热温度的研究和优化,提高了热解吸和传热效率,提高了磺胺类药物分子在气相中的游离分子浓度,降低了在DBDI中的检出限。相较于DBDI-MS, HAD-DBDI-MS使5种磺胺类药物的检出限普遍降低1～2个数量级,有效地提升了鸡肉和饲料基质中磺胺类药物的检出能力。采用HAD-DBDI的方法可以通过简单前处理,实现禽类肉制品和饲料中磺胺类药物的快速检测,该方法快速、可靠,对家禽养殖行业的市场监管具有重要意义。后续可以进一步探索HAD-DBDI的裂解规律,以及辅助机理和裂解规律的关系,并进一步拓展应用领域。