运输应激对小鼠肠道的病理损伤及Bcl-2 和Bax 表达的影响

温宇婷，刘 犇,2*，章志涛，张雯苑，梅 婷，彭瑞妮,2

（1.宜春学院 生命科学与资源环境学院，肉牛羊疾病控制实验室，江西宜春 336000；2.江西绿科农牧科技有限公司，江西宜春 336000）

为促进区域畜牧业的发展以及满足当地市场需求，动物跨区域运输频繁，如异地引种、畜禽的跨区域转运与交易等。在转运过程中不可避免地会引起动物的应激反应及伤害[1-3]。在畜禽转运过程中存在着诸多的应激因素，如颠簸摇晃、拥挤、噪音和温湿度的改变以及运输途中的饲料和饮水的减少，在这些因素作用下机体会产生适应性和防御性反应，即运输应激[2]。运输强度的不同对动物产生的影响也会有差异，一定的应激强度可以提高动物的适应力，若应激源强度大，则可能抑制炎症和免疫反应，降低动物机体的抗感染力，从而直接引发或者继发一系列疾病[4]，如呼吸和消化系统疾病，降低畜禽生产性能，严重时可引起动物死亡，造成较大的经济损失。

动物机体正常组织内稳态的维持反映在细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡[5]。在各种凋亡调控的基因中Bcl-2 家族受到广泛关注，其中Bcl-2 和Bax 在调控细胞凋亡过程中起重要作用。研究表明，正常情况下，Bcl-2 和Bax 蛋白在机体内表达相对稳定，当外界环境改变时则会引起两者表达失衡，若Bax 表达量过多会引起Bax 和Bax 的同源二聚体增多，对机体细胞表现为促凋亡；若Bcl-2 超表达，Bax 和Bcl-2 结合的异源二聚体变多，对机体细胞表现为抗凋亡作用[6-7]。正常情况下肠黏膜细胞的凋亡参与肠道黏膜细胞的自我更新，在增殖和凋亡过程中保持相对稳定才能确保肠道的正常功能，任何对细胞凋亡程序有促进作用的因素都会影响肠道功能的正常运作[8]。本研究通过组织切片的观察、免疫组化定位和Western Blot 定量法，探究运输应激对小鼠小肠的结构完整性及肠细胞中Bcl-2、Bax 表达的影响，为阐明运输应激对动物肠道损害及机理提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物及处理 16 只健康合格的雄性ICR 小鼠购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，购回后适应性饲养3 d 后随机分为对照组和处理组，每组8 只。试验当天处理组8 只小鼠放置在小鼠笼中，在35℃、160 r/min 恒温摇床的体外人工模拟运输应激环境下（高温、振荡、噪音和拥挤等）处理2 h；对照组在24℃环境下饲养，除了禁食禁水外不做任何处理。试验结束后采取脱臼致死法将所有小鼠处死，快速剖检致死小鼠，并对各小鼠的十二指肠、空肠和回肠进行快速取样，一份用PBS 小心漂洗干净后，放入4% 的多聚甲醛溶液中固定48 h 以上，4℃保存备用；一份用PBS 漂洗干净后用锡箔纸小心包裹后，放于-80℃冰箱保存用于Western Blot 检测。

1.2 HE 染色 从固定液中切取适宜长度的肠组织，自来水漂洗24 h 以上，在梯度酒精中进行脱水处理，然后放入二甲苯酒精处理10 min，再放入二甲苯中进行透明，处理完毕后采用混合石蜡进行包埋、修块。制作连续切片（厚度5 μm），每间隔10 张取1 张，摊片、烘片处理后37℃保存备用。从对照组和处理组每只小鼠的十二指肠、空肠、回肠中各选取5 张切片，经二甲苯脱蜡，酒精水化后用蒸馏水浸泡，再入苏木精染液，分化后返蓝，随后入伊红染液，酒精脱水、二甲苯透明后封片。

1.3 免疫组织化学 从对照组和处理组的每只小鼠中各随机选取1 张切片进行试验，并随机选取对照组、处理组各1 张切片做空白对照。二甲苯脱蜡，酒精处理，经蒸馏水、PBS 浸泡后，将切片浸入柠檬酸缓冲液中，置于微波炉中进行抗原修复。随后按照兔SP 试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司，SP-9001）说明书，用过氧化物酶阻断剂进行阻断，PBS 洗涤，用山羊血清工作液封闭、37℃一抗孵育2 h，Anti-Bax 抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，ab33020）和Anti-Bcl-2 抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司，ab7973）稀释浓度均为1:800，各肠段一抗浓度一致，PBS 洗涤，兔SP 试剂盒中二抗37℃孵育15 min，PBS 洗涤，用辣根酶标记卵白素工作液37℃孵育10 min，洗涤，最后使用DAB（北京中杉金桥生物科技有限公司，ZLI-9018）显色。经苏木精复染、脱水、透明，封片。试验重复3 次。结果判定：阳性细胞胞浆或细胞核呈黄色或褐色。

1.4 Western Blot 总蛋白提取试剂盒（P1250）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P1511）购自北京普利莱基因有限公司，按照说明进行总蛋白的提取及蛋白浓度的测定。将 Loading Buffer 与蛋白原液以1:3 的比例配制蛋白上样品。上样之前将上样品于90℃下热处理10 min，每孔加入15 μL 上样品。待样品在90 V 电压下从浓缩胶跑至分离胶后，将电压改至120V，直到跑完分离胶。然后在300 mA 电流下湿转，进行85 min。用5%的脱脂奶粉封闭2 h 后，4℃条件下进行一抗孵育16 h，一抗Bcl-2（C-2）（SNATA CRUZ BIOTECHNOLOGYINC，sc-7382）、Bax（2D2）（SNATA CRUZ BIOTECHN OLOGYINC，sc-20067）、Mouse Anti-β-Actin（BOSTER公司，BM0627）的稀释浓度均为1:1 000，洗膜后二抗室温孵育2 h，山羊Anti-Mouse lgG H&L(HRP)(艾博抗（上海）贸易有限公司，ab6789) 二抗稀释浓度均为1:10 000。按照超敏化学发光检测试剂盒（US EVERBRIGHT INC，S6009）说明操作后，用化学发光成像系统（Amershamlmager 600）拍照。

1.5 统计分析 用Image-Pro Plus 6.0 软件对图像进行分析，用SPSS19.0 软件对数据进行独立样本t 检验，结果记为平均值± 标准差，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 小鼠小肠的病理学观察 如图1 所示，与对照组相比，处理组十二指肠肠黏膜上皮细胞坏死、脱落，黏膜层增厚；在空肠中可见明显的肠绒毛断裂，并伴有肠腺上皮细胞脱落；回肠固有层和肠腺周边可见明显的淋巴细胞浸润。

2.2 Bcl-2 和Bax 在小鼠小肠的表达情况

2.2.1 小鼠十二指肠Bcl-2 和Bax 的表达情况 如图2所示，对照组和处理组中Bcl-2 都呈弱表达，两者表达情况无变化，表达部位均分布在肠绒毛的上皮细胞以及肠腺细胞胞质内，在对照组还可见隐窝底部表达。2 组中Bax 主要在肠黏膜上皮细胞和隐窝细胞胞质中弱表达，在杯状细胞周边中等表达，在坏死肠腺中高表达，处理组比对照组在肠黏膜上皮细胞中的表达增强。

2.2.2 小鼠空肠Bcl-2 和Bax 的表达情况 如图3 所示，Bcl-2 在对照组中呈弱表达，在绒毛上皮细胞偶见表达，处理组中Bcl-2 表达增强，明显可见在脱落的肠黏膜上皮细胞中Bcl-2 高表达，肠腺细胞胞质也相比对照组表达增强。Bax 在处理组中的表达比对照组明显增强，对照组中Bax 在肠腺开口处有弱表达，处理组在肠腺细胞胞质以及胞核处高表达，在绒毛断裂处也高表达。处理组中Bcl-2 更多在肠绒毛表达，而Bax 在肠绒毛上皮细胞弱表达，在肠腺中高表达。

图1 运输应激对小鼠小肠结构的影响

图2 十二指肠Bcl-2 和Bax 的表达

2.2.3 小鼠回肠Bcl-2 和Bax 的表达情况 如图4 所示，对照组中Bcl-2 中等表达，主要表达于肠黏膜上皮细胞和肠腺细胞胞质，黏膜肌层的平滑肌细胞也有表达，Bcl-2 在处理组中表达增强，增生的黏膜上皮细胞和平滑肌细胞中高表达，肠腺上皮细胞的表达也增强。Bax在对照组中弱表达，在少数肠黏膜上皮细胞和隐窝底部中等表达，处理组在肠黏膜上皮细胞中弱表达，但肠腺和破损的肠绒毛上皮细胞中高表达。

2.3 Bcl-2 和Bax 在小鼠小肠表达量的变化情况 如图5、6、7 所示，与对照组相比，处理组Bcl-2 和Bax 在十二指肠中的表达均提高（P＜0.01），在回肠中表达量增加（P＜0.05），但在空肠中表达量的变化无显著差异。3 个肠段对照组与处理组的Bcl-2/Bax 比值也无显著差异，与对照组相比，处理组十二指肠中两者比值呈下降趋势，空肠和回肠处理组两者比值高于对照组。

3 讨 论

图3 空肠Bcl-2 和Bax 的表达

图4 回肠Bcl-2 和Bax 的表达情况

图5 小鼠十二指肠Bcl-2（n=24）和Bax（n=24）的相对表达量

图6 小鼠空肠Bcl-2（n=24）和Bax（n=24）的相对表达量

图7 小鼠回肠Bcl-2（n=24）和Bax（n=24）的相对表达量

肠道含有丰富的血管网和大量腺体组织，是动物消化吸收的主要器官[9]。肠道的健康及完整性对动物的生长发育和健康至关重要。有研究指出，肠道的组织形态结构遭受破坏会导致肠道内细菌和毒素透过肠黏膜进入机体循环，促使大量炎性因子的释放，产生自由基，同时会使肠道的营养吸收功能受到抑制[8]。肠黏膜是肠道的第一层免疫屏障，其结构的完整性是维持肠道功能正常的基础[10]。本试验中，通过苏木精-伊红染色法发现运输应激会导致小肠出现不同程度的病理损伤，结构完整性遭到破坏，主要表现为肠绒毛的断裂、肠腺和肠黏膜细胞的脱落。十二指肠在小肠中的重要作用是分泌小肠液，运输应激后可发现大量肠黏膜上皮细胞坏死脱落以及出现了肠黏膜上皮增生变厚的现象，这都不利于肠道的分泌功能。空肠和回肠出现肠绒毛断裂，肠腺坏死变性，并伴有炎性细胞浸润，反映出运输应激对小鼠肠道造成了严重损伤。动物在长途运输后出现的食欲下降甚至废绝、腹泻等消化道疾病可能是受肠道结构完整性受到破坏所致[4]。

Bcl-2 定位于线粒体、内质网和核膜这些活性氧产生的场所，Bcl-2 对氧自由基产生影响不大，但可以防止细胞成分受到氧化损伤[5]。位于线粒体外膜上的Bcl-2 可以通过抑制谷胱甘肽向外转运，使线粒体巯基维持在还原状态；负调控细胞色素c、凋亡诱导因子AIF 等其他促凋亡因子的表达；通过改变凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1 的结构抑制凋亡蛋白酶的激活等途径来组织细胞的凋亡与氧化[11]。Bax 则通过从胞浆转运至线粒体膜上，改变线粒体膜结构，促进细胞色素c 的释放，诱导凋亡[12]。Bax 和Bcl-2 是一对互为拮抗的蛋白，它们之间的共同作用决定着细胞的死亡[13]。本试验中免疫组化结果显示，对照组小鼠Bcl-2 和Bax 在肠道内有弱表达；运输处理2 h 小鼠十二指肠中2 个蛋白表达无明显变化，空肠和回肠中Bcl-2 在肠绒毛断裂、肠黏膜上皮细胞增生及黏膜上皮细胞破损处表达增强；处理组中Bax 在空肠和回肠的肠腺细胞胞浆中高表达，相比于对照组明显增强，说明这些部位进行激烈的凋亡和抗凋亡作用，而上述部位又是肠道行使相关功能的主要部位。Western Blot 试验结果显示，与对照组相比，处理组2 种蛋白除了空肠表达增加不明显外，其他2 个肠段（十二指肠和回肠）Bcl-2 和Bax 的表达量都显著增加。十二指肠中Bcl-2/Bax 比值稍下降，而空肠和回肠Bcl-2/Bax 比值略微上升，这同以往研究表明应激引起Bcl-2/Bax 比值降低的结果有出入[14]，可能是本试验运输2h 未引起机体强烈反应。

虽然运输2 h 提高了Bax 表达量，但是应激的本质是机体适应环境做出的适应性反应，应激反应实际上是一个适应和抵抗适应的发生发展过程[15]。有学者指出，运输应激对细胞因子产生的影响呈时间依赖性[16]。研究表明，动物处于应激状态时减少胰岛素的分泌有利于降低应激源对机体的作用，而糖皮质激素、胰高血糖素、IL-6 等的分泌和运输过程中的禁食处理会抑制胰岛素分泌[17]。许利凡等[18]研究发现，夏南牛在运输2 h 后血清中促肾上腺皮质激素和皮质醇较运输1 h 显著上升，促肾上腺皮质激素能够促进糖皮质激素的分泌。促肾上腺皮质激素和皮质醇在运输应激中的增加都有利于减少胰岛素的分泌，从而减轻应激原的作用，保护机体，影响机体在应激反应中细胞凋亡程序的发展。刘犇[19]研究发现，运输2 h 后的山羊空肠HSP70 表量达比运输6 h 后显著增加。HSP70 作为体内的分子伴侣蛋白，在动物发生应激反应时通过抗凋亡作用对细胞起到保护作用[20]。以上研究表明机体处于运输应激状态时机体可以通过调节体内激素、炎症因子、相关蛋白等的表达和分泌对抗应激，保护机体。运输2 h 动物可能正处于对抗应激状态，肠道内凋亡蛋白和抗凋亡蛋白同时升高，在体内进行激烈抵抗。但是随着运输时间的增加，机体分泌调节的能力下降，动物体内的凋亡率可能也会随之上升。运输应激的产生、调控以及动物机体和运输应激之间的作用极为复杂，抗凋亡与促凋亡之间可能存在着转变，而这个转变很大程度上取决于应激的时间与强度。

综上所述，35℃、160 r/min 处理2 h 会对小鼠小肠结构的完整性造成较为严重的损伤，损伤部位主要是肠绒毛和肠腺等肠道行使功能的部位；Bcl-2 和Bax 在小肠不同肠段中都有表达，在该强度的运输应激下，处理组十二指肠和回肠Bcl-2 和Bax 的表达量明显高于对照组，空肠和回肠Bcl-2/Bax 比值运输后有升高趋势，十二指肠Bcl-2/Bax 比值降低，可见，运输后肠道Bcl-2、Bax 的表达以及Bcl-2/Bax 比值发生了变化，表明运输应激对肠道的损伤作用与细胞凋亡途径有关，可通过Bcl-2 和Bax 蛋白进行调节。