性别因素对苏尼特羊背最长肌肌内脂肪沉积的影响及相关性研究

高 栋，高爱琴，冀 祥，李 卿

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010000）

苏尼特羊属于内蒙古绵羊系统中的一类，在内蒙古锡林郭勒盟大草原上经过长期的自然生长与人工选择培育而成，其产肉性能好，瘦肉率高，蛋白高、脂肪低，膻味轻，于1986 被批准为地方良种，1997 年被内蒙古政府正式命名[1]。众多研究认为最佳的肌内脂肪（IMF）含量为2.0%～3.0%[2-5]，苏尼特羊IMF 含量平均3.14%，表现出很好的肉品质。肉品质包括物理性参数和化学性参数，其中脂肪酸影响着肉的风味和抗氧化能力，而脂肪酸又受到基因、日粮、品种、性别、年龄等因素调控[6]。大部分对肉羊肉品质影响的研究主要从饲喂方式、日粮和月龄等因素进行，本实验则主要对性别因素对苏尼特羊肉品质造成的影响进行研究。本研究以6 月龄苏尼特公母羊为实验动物，研究性别因素对苏尼特羊肌内脂肪、脂肪酸沉积量、脂肪酸代谢基因mRNA 表达量和脂肪酸代谢酶活的影响，并对脂肪酸代谢基因表达量与肌内脂肪和脂肪酸含量、脂肪酸代谢酶活与肌内脂肪和脂肪酸含量进行相关性分析，为后期苏尼特羊的脂肪沉积研究以及生产活动提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 在内蒙古苏尼特右旗改良站选取舍饲6月龄、体重35 kg 左右苏尼特羊公、母各12 只。屠宰后，采取一部分背最长肌放入液氮中保存用于RNA 的提取，另一部分-20℃保存用于IMF 含量、脂肪酸、酶活的测定。

1.2 IMF 测定 采用索氏抽提法测定脂肪含量，将滤纸切成8 cm×8 cm，叠成一边不封口的纸包，用硬铅笔编写顺序号，按顺序排列在培养皿中。将盛有滤纸包的培养皿移入（105±2）℃烘箱中干燥2 h，取出放入干燥器中，冷却至室温。按顺序将各滤纸包放入同一称量瓶中称重、称量时室内相对湿度必须低于70%。在上述已称重的滤纸包中装入3 g 左右研细的肉样，封好包口，放入（105±2）℃的烘箱中干燥3 h，移至干燥器中冷却至室温。按顺序号依次放入称量瓶中称重。将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67 倍的无水乙醚，使样品包完全浸没在乙醚中。连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒温水浴中进行抽提，调节水温在70～80℃，使冷凝下滴的乙醚成连珠状（120～150 滴/min 或回流7 次/h 以上），抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止（需6～12 h）。抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，在通风处使乙醚挥发（抽提室温以12～25℃为宜）。提取瓶中的乙醚另行回收。待乙醚挥发之后，将滤纸包置于（105±2）℃烘箱中干燥2 h，放入干燥器冷却至恒重为止。

1.3 脂肪酸测定 称取5 g 粉碎肉样，参照Folch 等[7]的方法提取各组织中的总脂肪，加入5 mL 0.5 mol/L 的NaOH-CH3OH 溶液进行脂肪皂化（70℃、5 min），再加入5 mL 的BF3-CH3OH（1:3，V/V）溶液进行脂肪的甲酯化（70℃、2 min），最后加入3 mL C6H14萃取（70℃、1 min），加入5 mL 饱和NaCl 溶液后静置10 min，分层后吸1 mL 正己烷层于进样瓶中进行气相色谱分析。

1.4 背最长肌脂肪酸代谢基因mRNA 表达量的测定 采用实时荧光定量PCR 扩增技术检测6 月苏尼特母羊、公羊脂肪代谢关键基因心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）以及脂代谢关键酶基因乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）和脂蛋白酯酶（LPL）的mRNA 表达量。

1.4.1 引物设计与合成 以GAPDH为内参基因，参考GenBank 绵羊的H-FABP、ACC和LPL基因引物序列，合成机构为北京六合华大基因科技有限公司，-20℃保存。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.2 RNA 的提取 取待测组织样在研钵中加液氮研磨至粉末状，转移到1.5 mL Free-RNase 离心管中，加入1 mL Trizol 溶液，振荡混匀，在冰上静置10 min，4 ℃ 12 000×g 离心5 min；取上清加入300 μL 氯仿（冰），振荡混匀至充分乳化，冰上静置10 min，4℃12 000 r/min 离心15 min；取上清加入等量异丙醇（冰），轻轻颠倒混匀，冰上静置10 min，4℃ 12 000 r/min 离心15 min（此时会有羽毛状沉淀）；弃上清，留沉淀，加入1 mL 75%冰乙醇，反复吹打使羽毛状沉淀在溶液中飘荡几次4℃ 12 000 r/min 离心5 min；弃乙醇，留沉淀，晾干，加适量Free-RNase H2O 溶解。取部分检测提取出的RNA 完整性和纯度。

1.4.3 RNA 反转录合成cDNA 采用 TaKaRa RRO36A试剂盒于PCR 仪中合成cDNA，H-FABP、ACC、LPL反应体系：5xPrime Script RT Master Mix 4 μL，Total RNA 2 μL，Free-RNase H2O 14 μL，Total 20 μL。反应条件：37℃转录反应15 min，85℃反转录酶失活5 s，4℃时结束，-80℃保存。

1.4.4 实时荧光定量PCR 采用 TaKaRa RR820A 试剂盒，在荧光定量仪中进行实时荧光定量测定，20 μL PCR 反应体系：SYBR premix Ex Tap 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，模板（c DNA）2 μL，Free-RNase H2O 6.4 μL。反应程序：40 个循环，95℃预变性 30 s，95℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s。

1.5 背最长肌脂肪酸代谢相关酶活的测定 将背最长肌组织样制成10% 组织匀浆，离心取上清待测。利用考马斯亮蓝法测出总蛋白，然后利用酶联免疫检测试剂盒对脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）、甘油三酯水解酶（ATGL）活性进行测定。

1.6 统计分析 利用Excel 2007 初步整理数据，用SAS统计软件进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差来表示，并以P＜0.05 为差异显著性的评判标准。相关性分析用SPSS 22 进行Pearson 相关系数分析。

2 结果与分析

2.1 性别因素对苏尼特羊肌内脂肪和脂肪酸含量的影响由表4 可以看出，性别因素对苏尼特羊肌内脂肪影响显著。6 月龄苏尼特公母羊饱和脂肪酸（SFA）主要以豆蔻酸（C14:0）、棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C16:0）为主，母羊豆蔻酸（C14:0）显著高于公羊，公母羊之间棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）差异不显著。单不饱和脂肪酸（MUFA）主要以豆蔻油酸（C14:1）、棕榈油酸（C16:1）、油酸（C18:1）为主，其中母羊棕榈油酸沉积量显著高于公羊，其余2 种差异不显著。多不饱和脂肪酸（PUFA）主要以亚油酸（C18:2）、亚麻酸（C18:3）、花生四烯酸（C20:4）为主，性别因素对3 种饱和脂肪酸没有显著影响。性别因素对总脂肪酸（FA）、SFA、不饱和脂肪酸（UFA）总量、P/S 值、U/S 值、n-6:n-3 比值影响均不显著。

表4 6 月龄苏尼特羊背最长肌肌内脂肪和脂肪酸含量

2.2 性别因素对苏尼特羊背最长肌中脂肪酸代谢基因mRNA 表达量的影响 表5 显示，不同性别因素对脂肪沉积关键基因H-FABP、ACC有显著影响，公羊背肌中脂肪沉积关键基因H-FABP的表达量与母羊相比下调49%（P＜0.05），ACC与母羊相比下调59%（P＜0.05）；性别因素对LPL影响不显著。

表5 6 月龄苏尼特羊背最长肌脂肪沉积相关基因的表达量

2.3 脂肪酸代谢基因表达量与肌内脂肪和脂肪酸含量相关性分析 由表6 可以看出，H-FABP基因与肌内脂肪具有正相关，相关系数为0.76。H-FABP基因与豆蔻油酸、油酸、CLA、亚麻酸、花生四烯酸没有相关性，与棕榈油酸相关性（r=0.42）。ACC也与棕榈油酸具有相关性（r=0.62），与其他饱和脂肪酸不具有相关性。

2.5 性别因素对苏尼特羊脂肪酸代谢酶活的影响 由表7 得出，性别因素ACC 影响显著，母羊ACC 的酶活显著高于公羊。而性别因素对FAS、ATGL 酶活的影响不显著。总体来看，母羊ACC、FAS、ATGL 3 种酶活高于公羊。

表6 苏尼特羊背最长肌脂肪沉积相关基因与肌内脂肪和脂肪酸的相关性（n=12）

表7 苏尼特羊背最长肌脂肪沉积相关酶的活性

2.7 脂肪酸代谢酶活与肌内脂肪和脂肪酸含量相关性分析 由表8 可以看出，ATGL 与肌内脂肪呈负相关。FAS 与豆蔻油酸、棕榈油酸、ɤ-亚麻酸没有相关性。但是与油酸、CLA 具有正相关，相关系数分别为0.41、0.43，与α-亚麻酸、花生四烯酸呈负相关，特别是与α-亚麻酸呈显著负相关（P＜0.05）。

表8 苏尼特羊背最长肌脂肪沉积相关酶活与肌内脂肪和脂肪酸的相关性（n=12）

3 讨 论

肉中脂肪和脂肪酸含量是影响肉品质的因素，也是被人类摄取以后是否对人类健康造成影响的重要指标[8]。羊肉中IMF 含量对羊肉的嫩度、风味以及大理石纹均有着重要的影响，也是影响羊肉品质的重要因素之一[9]。衡量羊肉营养价值的指标有PUFA 与SFA 的比值（P:S）和n-6 PUFA 与n-3 PUFA 比值（n-6:n-3）[10]。本研究结果表明，公羊豆蔻酸含量显著低于母羊，硬脂酸显著高于母羊。公羊棕榈油酸含量显著低于母羊，棕榈油酸在单不饱和脂肪酸中最具代表性，且是多不饱和脂肪酸合成的前体物质，单不饱和脂肪酸在降低胆固醇和血糖方面具有重要作用[11]。脂肪代谢过程中，相关基因和酶活起重要调控作用。H-FABP对长链脂肪酸的摄取，维持细胞内外脂肪酸浓度差以及脂肪代谢起到重要作用。ACC 是脂肪酸合成过程中的限速酶。LPL 是甘油三酯降解为甘油和游离脂肪酸反应的限速酶，与机体的脂质代谢及肥胖密切相关，若其含量过低，使得脂蛋白无法分解，体内脂质因不能分解利用而沉积导致肥胖[12]。FAS是脂肪酸从头合成过程中的关键酶。研究发现，FAS 的高水平表达能够促进甘油三酯在体内的沉积从而导致肥胖[13]。ATGL 是水解甘油三酯的关键酶，将甘油三酯水解为甘油二酯。本研究发现，性别差异导致H-FABP、ACC表达量差异显著，母羊的表达量显著高于公羊，而性别因素对LPL、FAS、ATGL没有影响。在相关性分析中，H-FABP与IMF 呈正相关，也就是说H-FABP对脂肪沉积起到正向调控作用。同时母羊的IMF 含量显著高于公羊。这也证实了在性别因素的影响下母羊H-FABP表达量高于公羊这一结论是正确的。本研究发现，性别因素对苏尼特羊脂肪沉积、脂代谢基因表达量有一定程度的影响；ATGL 活性与肌内脂肪呈负相关，FAS 活性与油酸和CLA 含量呈正相关，油酸是合成饱和脂肪酸的前体物质[14]，CLA 更是在生理上具有抗动脉粥样硬化、抗癌、抗肿瘤等重要作用[15]，这为后续的研究工作奠定了基础。

4 结 论

本研究结果表明，性别因素对苏尼特羊H-FABP、ACC表达量及酶活影响显著，并对IMF 影响显著，母羊显著高于公羊；在相关性分子中，脂肪沉积关键基因H-FABP与IMF 呈正相关，对肌内脂肪的沉积具有正向调控作用；FAS 对油酸和CLA 具有正向的调控作用。