用于牛奶中三聚氰胺测定的纸芯片研究

吕聪聪 张 柳 侯 越 刘 伟

(陕西师范大学 化学化工学院、陕西省生命分析化学重点实验室，陕西 西安 710119)

0 引言

三聚氰胺(C3H6N6)中的含氮量非常高(通常按照质量计为66.6%)，且有成本低的[1]特性.近年来，三聚氰胺被非法添加在婴幼儿配方奶粉、牛奶和宠物食品中，在检测时，其蛋白质的含量可以高于我们用凯氏定氮法测定的蛋白质含量，使消费者被误导.而这些产品在奶制品市场上获得廉价的价格.但三聚氰胺在和它的水解产物三聚氰酸结合后，却造成肾小管中不溶性结晶生成，这可能会使肾功能衰竭[2].因此，奶制品和其它食品中三聚氰胺的量需要严格控制.我国政府规定，三聚氰胺在婴幼儿食品和其它食品中的最大允许残留量分别为1.0 mg/kg和2.5 mg/kg[3].目前测定三聚氰胺含量的主要方法有色谱法[4]、毛细管电泳-质谱联用法[5]、电化学法[6]、表面增强拉曼散射光谱法[7,8]、荧光光谱法[9,10]，比色法[11]等.

而在这些检测方法中，目视比色法具有简单、快速、可适合现场检测及易普及的特点而引起人们的广泛关注.在纳米金比色法中，2011年前后，酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸[12]是主要的检测方法.通过合成未修饰或修饰过的Au纳米粒子，利用其与三聚氰胺发生团聚显色而发展了一系列的纳米金测定三聚氰胺含量的目视比色法[13,14].在近三年的研究中，利用其他方法修饰或适配体功能化的纳米金及未修饰的纳米银[15-18]，也达到对三聚氰胺检测的目的.但胶体金免疫层析试纸会涉及到喷金等操作，实验成本比较高，将纳米粒子滴涂在纸上会使其团聚，因此发展纳米粒子测定的纸芯片具有一定的难度.在利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-H2O2显色体系[22-26]来检测三聚氰胺的相关工作中，一般实验孵育时间比较长，且需要加热等操作，因此发展孵育时间短的TMB显色体系有一定的优势.近年来，纸芯片[19-21]以其具有成本低、易操作、可携带等优点而受到关注.本文旨在建立一种纸上测定三聚氰胺的快速测定方法，以辣根过氧化物酶(HRP)- TMB- H2O2显色体系[27-29]为基础，利用三聚氰胺可以使该显色体系的显色增强的现象，建立了一种比色法测定三聚氰胺的纸芯片.该显色方法不需加热等操作，室温孵育5 min即可测定，反应所需的试剂量很少，且具有即用即抛、不会产生样品交叉污染的特点.该方法测定三聚氰胺的检出限为5 μM，可实现牛奶样品中的三聚氰胺含量的快速测定.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：富士施乐蜡打印机(8570，富士施乐有限公司，美国)；佳能数码相机(Canon EOS 550D，日本)；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计(UV-1800，日本岛津仪器有限公司).

试剂及材料：Whatman 1号滤纸(200.0 mm×200.0 mm，Sigma)；辣根过氧化物酶(HRP)(上海雪满生物科技有限公司)(纯度：R.Z>3.1%)；3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(北京索莱宝科技有限公司)(纯度：>98%)；过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)(纯度：AR)；牛奶样品购于本地超市，试剂用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm).

1.2 纸芯片的制作

采用文献报道过的蜡打印法制作纸芯片[21,30,31]，首先用CorelDRAW X5画图软件设计直径为6 mm的纸芯片微区域，将设计的纸芯片按DXF格式保存后用切割控制软件(ROBO Master-Pro)打开后，将纸张放在模型版上，用切割机(Graphtec Craft Robo-S)切出所要的图形，将设计好的图案用蜡打印机打印，将打印好的纸芯片放在烘箱中，在150 ℃下加热150 s，蜡圈在高温下会融化并且渗透到纸纤维的内部，这样就会在纸芯片上形成疏水区域.

1.3 储备液的制备

20.0 mM 的TMB的制备：准确称取0.0480 g粉末状的TMB，用无水乙醇定容至10 mL，涡旋振荡 1 min，超声15 min.避光保存，备用.

1.0 mM三聚氰胺标准溶液的制备: 准确称取0.0126 g的三聚氰胺，用超纯水溶解后转移定容至100 mL.使用时逐级稀释.

1.4 三聚氰胺的检测

将1.6 μL的浓度为1.2 μM的HRP，3.0 μL 浓度为7.0 mM的TMB及2 μL的浓度为 0.7 mM的H2O2按顺序滴加到直径为6 mm的纸芯片上，室温反应5 min.作为对照组.按上述同样的方法，最后再将1.0 μL不同浓度的三聚氰胺标准溶液滴加到纸芯片上，室温反应5 min.以三聚氰胺的浓度为横坐标，以相对强度 (加入三聚氰胺前后，所测灰度的变化) 为纵坐标，绘制工作曲线.

1.5 市售牛奶样品处理

参照文献[32]的方法对市售牛奶处理.分别取5.0 mL牛奶(牛奶样品1，牛奶样品2，牛奶样品3)，加入 1.5 mL 2.0 M的三氯乙酸，涡旋振荡1min，超声处理10 min后，混合物以 13000 r/min 离心 10 min.取上清液过滤，用1 mol/L Na2CO3调至pH 8.0，再以 3000 r/min 离心3 min，取上清液，待用.

2 结果与讨论

2.1 比色法检测三聚氰胺的原理

实验中考查了HRP-TMB-H2O2及三聚氰胺加入该体系中的紫外可见吸收曲线，如图1所示，HRP-TMB-H2O2溶液呈浅蓝色(插图a)，吸收光谱为图1 中黑线，652 nm可产生特征吸收峰.向HRP-TMB-H2O2溶液中加入三聚氰后，溶液的颜色加深，变为较深的蓝色(插图 b)，652 nm处的吸收强度增加，且吸收位置不变 ( 图1，红线)，并未出现新的吸收带.HRP催化H2O2氧化TMB成为ox-TMB而显蓝色，在HRP-TMB-H2O2体系中添加三聚氰胺前后，吸收强度有所增加，是因为三聚氰胺可以提高过氧化物酶的催化速度[33]，在同样时间内，反应速度加快，在立即添加三聚氰胺后，使同一时间点颜色加深，表明反应中三聚氰胺可以增强HRP-TMB-H2O2的显色反应，起到催化的作用，并没有新的物质产生.

2.2 反应时间对体系的影响

对于TMB显色体系，显色时间长短会影响测定结果，因此首先考察显色时间的影响.在TMB、H2O2和HRP的浓度为7.0 mM、0.7 mM和1.2 μM时，在室温条件下，用一定浓度的三聚氰胺，测定了1-11 min内显色反应的相对强度变化值，结果如图2(a)所示，当显色时间达到5 min 时，反应具有最佳的显色效果.因此，选择显色反应时间为5 min.

2.3 pH对体系的影响

已有研究表明，pH对实验显色反应的效果起着重要作用[11]，当pH值低于3时，会影响到TMB-H2O2的性质，反应受到抑制.然而，如果pH过高，HRP会失活.因此在pH为3.0-7.0的范围内考察了pH对该显色反应的影响，结果如图2(b)所示.实验结果表明该体系在pH为4.5时体系有最佳的显色效果.

2.4 HRP、TMB、H2O2浓度对体系的影响

为了在最佳的显色体系下检测三聚氰胺，HRP、TMB、H2O2的浓度也需要优化，优化结果如图2(c)-(e)所示.在pH为4.5，反应时间为5 min，TMB浓度为7.0 mM、H2O2浓度为0.7 mM的条件下，在0.1-1.5 μM浓度范围内考察了HRP对显色体系的影响.随着HRP的浓度0.2-1.2 μM不断增大，所测的相对强度逐渐增大，当浓度大于1.2 μM时，相对强度逐渐减小，所以在以后的实验中，选择1.2 μM的HRP，结果如图2(c)所示.

在pH为4.5，反应时间为5 min，HRP浓度为1.2 μM、H2O2浓度为0.7 mM的条件下，在1-10 mM浓度范围内考察了TMB对显色体系的影响.随着TMB的浓度从1.0 mM到7.0 mM不断增大，所测的相对强度逐渐增大，当浓度大于7.0 mM时，相对强度逐渐减小，所以在以后的实验中，选择7.0 mM的TMB，结果如图2(d)所示.

在pH为4.5，反应时间为5 min，HRP浓度为1.2 μM、TMB浓度为7.0 mM的条件下，在0.1-1.0 mM浓度范围内考察了H2O2对显色体系的影响.随着H2O2的浓度从0.1 mM到0.7 mM不断增大，所测的相对强度逐渐增大，当浓度大于0.7 mM时，过氧化氢的分解对实验结果有影响，会使测定的相对强度逐渐减小，所以在以后的实验中，选择0.7 mM的H2O2，结果如图2(e)所示.

2.5 干扰实验

为了将本方法用于实际样品的检测，考察了牛奶中可能出现的物质[11]对三聚氰胺测定的影响.在上述所选的最佳实验条件下进行，即HRP的浓度为1.2 μM，TMB的浓度为7.0 mM，H2O2的浓度为0.7 mM，pH值为4.5这一条件下，进行干扰实验的测定.

在对照组和实验组中三聚氰胺的含量相等，进行干扰测定的实验组中逐一添加各干扰物，当干扰物质的浓度为三聚氰胺浓度的20倍时(实验中三聚氰胺的浓度为100 μM，其它物质浓度均为2 mM)，测其相应强度，再与对照组中只有三聚氰胺的响应信号进行对比，发现响应基本相当，说明该反应体系对三聚氰胺测定时，其他物质并不会明显的增加或者减弱响应信号，所以结果表明，20倍的Zn2+、K+、Ca2+、乳糖、葡萄糖、半胱氨酸、赖氨酸、甘氨酸、维生素C和胸腺嘧啶均不会影响牛奶中三聚氰胺的测定.

1.6 三聚氰胺标准曲线的绘制及线性分析

在所选择的最佳实验条件下，本研究利用比色法，通过观察纸芯片颜色的变化与三聚氰胺的浓度存在一定的线性关系，将纸芯片的颜色利用Image-J软件处理转化成灰度，在添加三聚氰胺前后灰度的差值即为相对强度.实验结果发现相对强度值与三聚氰胺的浓度在10 μM-1.0 mM呈现线性关系.为了获得更好的线性关系，我们采用分段线性的方法.针对10 μM -100 μM 和100 μM-1.0 mM两个不同的线性范围，线性回归方程分别为y=15.7x+19.7 (R2=0.9933)和y=4.7x+26.3 (R2=0.9843) (其x单位为10-4M) 如图4所示.随着三聚氰胺浓度的增大，其相对强度也逐渐增强.对不同浓度梯度的三聚氰胺进行了5次平行测定，相对标准偏差为3.1 %.

表1 三聚氰胺检测各比色方法的对比

该方法的检出限为5 μM，且选取几种不同的比色方法从检出限，线性，反应条件，所用方法这几个方面进行对比，该研究所需时间短，不需加热，并列表对其检出限进行对比，如表1所示.

2.7 样品加标回收测定

为了评价本实验方法的可靠性和实用性[34-36]，我们将本方法用于测定牛奶中三聚氰胺的含量.将一定量的三聚氰胺标准溶液加入到样品溶液中，实验数据如表2所示，观察样品溶液中加入三聚氰胺标准品前后的回收率变化，结果表明该方法可靠且本方法可以用于实际牛奶样品的检测.

表2 三聚氰胺加标回收样品测定结果

3 结论

本研究在纸芯片上利用HRP-TMB-H2O2显色体系成功实现了牛奶中的三聚氰胺含量的检测，未加入三聚氰胺时，纸芯片呈现浅蓝色，加入三聚氰胺后，显色反应增强，基于上述现象，以纸芯片为反应载体，通过比色法可以建立快速测定三聚氰胺的比色分析方法.该方法测定三聚氰胺的检出限为5 μM.由于纸芯片具有反应所需的试剂量很少、即用即抛及样品不会交叉污染的特点，因此该方法开辟了一种简单快速、低成本的纸上检测三聚氰胺新途径.