大黄素对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞外泌体水平和氧化应激的调控作用

蔡青云，许丽君

1)驻马店市中心医院急诊科 河南驻马店 463000 2)河南省人民医院急诊科 郑州 450003

既往研究[1]报道，大黄素在治疗急性胰腺炎过程中具有重要作用，但是大黄素治疗胰腺炎的作用机制仍是一个需要深入研究的问题。外泌体是多种细胞分泌的纳米大小的细胞外囊泡，在体内随处可见。在过去几年里外泌体从被认为是细胞的垃圾桶，发展到被认为是细胞间信使和健康、疾病过程中具有重要贡献的参与者[2-3]。据报道[4]，外泌体在神经退行性疾病、炎性疾病中均具有重要作用，但是其对急性胰腺炎的作用尚不十分清楚。本研究观察了大黄素对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞氧化应激标志物SOD、GSH、MDA表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1标本、细胞及主要试剂急性胰腺炎患者和正常对照血清标本各35例，均由河南省人民医院急诊科于2018年10月至2019年11月收集。急性胰腺炎患者中，男21例，女14例，年龄25～70岁，中位年龄40岁；正常对照为同期体检健康者，男20例，女15例，年龄22～75岁，中位年龄45岁。大鼠胰腺外分泌细胞AR42J购自美国菌种保藏中心；DMEM培养基购自美国Sellect公司；大黄素(批号20161028)购自北京索莱宝公司；雨蛙素购自美国Sigma公司；淀粉酶(AMY)ELISA检测试剂盒购自英科新创(厦门)科技有限公司；TNF-α、GSH、SOD、MDA ELISA检测试剂盒均购自美国Bio Science公司；磁珠购自上海秉宏科技有限公司；细胞液外泌体提取试剂盒购自杭州知维生物科技有限公司。

1.2血清中外泌体表面抗原CD69的检测血清中外泌体的分离参照文献[5]的方法。将100 μL磁珠用300 μL MEST洗涤2次，再用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化(37 ℃30 min)；加入5 μL CD69抗体，37 ℃摇床孵育3 h，移去上清，PBST重悬，反应30 min，PBST清洗3次；加入50 μL外泌体溶液，37 ℃摇床孵育1 h，除去上清，PBS洗涤3次。加入0.5 mL 30 μmol/L Dio染料，孵育30 min，弃上清，用无水乙醇清洗，PBS重悬，上流式细胞仪测量CD69的表达情况。

1.3AR42J细胞培养上清中AMY、TNF-α的检测AR42J细胞用含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养，记为对照组；用10-7mol/L雨蛙素处理AR42J细胞24 h诱导为胰腺炎模型细胞，记为模型组。分别用AMY、TNF-α ELISA检测试剂盒检测2组细胞培养上清中AMY活性、TNF-α含量，具体操作步骤参考试剂盒说明书。实验重复3次。

1.4不同浓度大黄素处理后AR42J模型细胞增殖抑制率的检测采用大黄素(0、10、20、30 μmol/L)处理模型AR42J细胞48 h，分别记为0、10、20、30 μmol/L大黄素组，使用MTT法检测各组细胞的增殖抑制率。将细胞制成混悬液，调整密度至104个/mL，然后取100 μL接种至96孔板，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，孵育4 h，弃去培养液，然后每孔加入150 μL DMSO，振荡使结晶充分融解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞增殖抑制率=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。每组3个复孔，实验重复3次。

1.5大黄素处理后AR42J模型细胞培养上清中SOD、GSH、MDA活性及CD69的检测用大黄素20 μmol/L处理模型细胞48 h，记为大黄素组；采用DMSO代替大黄素做阴性对照处理模型细胞，记为阴性对照组；另设模型组。采用GSH、SOD、MDA ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清中GSH、SOD、MDA活性；CD69的检测方法同1.2。每组3个复孔，实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析。正常对照组和急性胰腺炎组血清中CD69表达水平的比较、对照组和模型组AR42J细胞培养上清中AMY活性、TNF-α含量的比较均采用两独立样本的t检验；不同组间细胞增殖抑制率，SOD、GSH、MDA活性及CD69表达水平的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1正常对照组和急性胰腺炎组血清中CD69表达水平的比较与正常对照组[(20.95±2.25)%]相比，急性胰腺炎组血清中CD69的表达水平[(83.98±6.29)%]升高(t=28.306，P<0.001)。

2.2对照组、模型组细胞培养上清中AMY活性、TNF-α含量的比较结果见表1。与对照组相比，模型组细胞培养上清中AMY活性、TNF-α含量均升高。

表1 对照组、模型组细胞培养上清中AMY活性、TNF-α含量的比较(n=3)

2.34组细胞增殖抑制率比较结果见表2。与0 μmol/L大黄素组相比，10、20、30 μmol/L大黄素组细胞增殖抑制率均升高，20、30 μmol/L大黄素组升高更显著。故选用20 μmol/L大黄素用于后续实验。

表2 4组细胞增殖抑制率的比较(n=9)

F=516.374，P<0.001；*：与0 μmol/L大黄素组比较，P<0.05；#：与10 μmol/L大黄素组比较，P<0.05

2.43组细胞培养上清中SOD、GSH、MDA活性及CD69表达水平的比较结果见表3。与其他2组相比，大黄素组细胞培养上清中SOD、GSH活性均升高，MDA活性、CD69表达水平降低。

表3 3组细胞培养上清中SOD、GSH、MDA活性及CD69表达水平的比较(n=9)

*：与其他2组比较，P<0.05

3 讨论

大黄最早是在《神农本草经》中记载，其在中国的临床应用已有2 000多年。近代医学认为大黄具有下淤、通下的功能，常用来治疗胰腺炎、胆囊炎等炎性疾病。重症急性胰腺炎发病急，极易引起全身感染，病死率极高。据报道[5]，在重症急性胰腺炎早期阶段应用大黄治疗可明显减轻患者的腹痛、恶心、呕吐症状。大黄素是大黄的主要成分之一，可治疗胰腺炎[6]。李慧艳等[7]报道，大黄素联合黄芩苷可抑制急性胰腺炎大鼠的氧化应激反应。本研究采用雨蛙素建立AR42J细胞损伤模型，大黄素(0、10、20、30 μmol/L)处理模型细胞，筛选最适浓度20 μmol/L；进一步研究发现，大黄素治疗可使细胞中抗氧化应激标志物SOD、GSH活性上调，氧化应激标志物MDA活性下调，说明大黄素可减弱炎性损伤的胰腺腺泡细胞的氧化应激反应，这与以往报道[7]结果一致。

近年，外泌体的研究成为热点。外泌体可携带脂质、蛋白质和遗传物质，在病理生理条件下将内含物在母体细胞和靶细胞之间传递，参与机体免疫应答、炎症、肿瘤生长、神经退行性疾病等病理生理过程[8-10]。李腾达等[4]报道，自身免疫性胰腺炎患者血清中外泌体表面抗原CD69表达水平升高，并刺激CD4+T细胞分泌IL-4、IFN-γ、TGF-β，参与胰腺炎的病程。还有报道[11]，重症急性胰腺炎小鼠的脾脏T细胞中CD25和CD69表达水平升高，小鼠免疫应答得到激活。本研究中发现，CD69水平在急性胰腺炎患者血清中异常升高；大黄素处理的急性胰腺炎胰腺腺泡细胞中CD69表达水平降低，提示大黄素对急性胰腺炎的治疗作用可能与减少外泌体有关。

综上所述，大黄素可抑制急性胰腺炎胰腺腺泡细胞的氧化应激反应，下调外泌体水平，这为大黄素的临床应用提供了理论依据。