昆仑雪菊油树脂成分分析及体内外抗氧化性活性研究

杨金梅,王德萍

(新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046)

昆仑雪菊(Kunlun chrysanthemum)原产于美国的中西部地区,又名金鸡菊,主要分布在海拔高度3000 m左右的新疆和田地区,是新疆区域比较有特色的菊花品种之一,昆仑雪菊主要含有黄酮、多糖、皂苷、氨基酸、挥发油等成分,具有降血脂、降血压、抗癌、抗衰老等作用[1-3]。昆仑雪菊油树脂(Kunlun chrysanthemum oleoresin)是采用超临界的方法将昆仑雪菊花中的香气和风味成分萃取出来,再利用溶剂蒸馏回收,制成黏稠状的昆仑雪菊油树脂。因为昆仑雪菊油树脂能代表香辛料中的香气、有效成分以及风味,几乎能把香辛料中全部的风味和香气成分表现出来,因此昆仑雪菊油树脂在特性和应用方面具备了比昆仑雪菊花更突出的优点[4-7]。

自由基是生物体内新陈代谢过程中产生的一类具有高度活性、含有未配对电子的物质,过量的自由基会导致生物膜、酶、维生素、蛋白质及活细胞功能过氧化损伤。氧化应激(Oxidative stress,OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡,倾向于氧化,导致中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物,在体内是一种负面作用[8]。而消除氧化应激最有效的方法是使用抗氧化剂[9]。研究表明,油树脂的成分主要有精油、辛辣成分、色素、树脂及一些非挥发性的油脂和多糖类化合物。与精油相比,油树脂的香气更丰富,口感更丰满,具有抗菌、抗氧化等功能。油树脂能大大提高香料植物中有效成分的利用率。例如,桂皮直接用于烹调,仅能利用有效成分的25%,制成油树脂则可达95%以上。可见,油树脂已成为辛香料的重要发展方向[10-11]。且研究表明,有些草本植物、香辛料以及其提取物具有抗氧化活性[12]。因此,有必要对昆仑雪菊油树脂进行成分分析及体内外抗氧化性活性研究。

本实验采用超临界的方法制备昆仑雪菊油树脂,采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对雪菊油树脂脂肪酸进行成分分析,通过昆仑雪菊油树脂对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)、羟基自由基(·OH)的清除率的测定,总还原能力的体外实验以及测定小鼠血清、肝脏和肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和总抗氧化(T-AOC)能力的体内实验,从而研究雪菊油树脂脂的体内外抗氧化特性,以期为昆仑雪菊的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆仑雪菊 由新疆和田沙漠玫瑰有限责任公司提供;T-AOC试剂盒、SOD试剂盒、MDA 试剂盒 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) (纯度>97%),上海源叶生物科技有限公司;昆明小鼠6～8周龄,体重20±2 g 新疆医科大学动物饲养中心购买,实验动物生产许可证号:SCXK(新)2011-0003,新疆维吾尔自治区科学技术厅颁发;硫酸亚铁、过氧化氢、无水乙醇等试剂 均为市售国产分析纯。

HH-S24型电热恒温水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂;FW-100高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;512GD紫外-可见光分光光度计 上海分析仪器总厂;DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;SFE221-50-06超临界萃取装置 南通华兴石油仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;Spe-edTM SFE-2玻璃仪器气流烘干器 Universal Analytical & Test Instrument Ltd.;QP2010气相色谱-质谱联用仪 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 昆仑雪菊油树脂的制备 制备流程[13]:昆仑雪菊花干燥粉末→超临界CO2萃取→离心(3500 r/min,15 min)→收集上清液→旋蒸乙醇→昆仑雪菊油树脂。

操作要点:将昆仑雪菊花经过电热恒温鼓风干燥箱60 ℃干燥,再通过高速万能粉碎机粉碎成粉末,过60目筛,再通过超临界CO2萃取。超临界CO2萃取条件:萃取时间100 min、萃取温度45 ℃、萃取压力20 MPa、夹带剂用量150 mL、CO2流量为20 L/h,从分离釜取出昆仑雪菊油树脂,在60 ℃的条件下旋蒸去除无水乙醇,得到昆仑雪菊油树脂。

1.2.2 昆仑雪菊油树脂脂肪酸成分分析 所得昆仑雪菊油树脂用无水硫酸钠脱水,过滤后量取体积。取适量油树脂用正己烷溶解稀释为体积分数0.1%,用于气相色谱-质谱联用分析。样品测定前置于-25 ℃下密封贮存。

1.2.2.1 甲酯化处理 吸取-25 ℃下密封贮存的昆仑雪菊油树脂3 mL于试管中,加入5 mL石油醚和乙醚(V/V=4∶3)混合溶液,加入0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液4 mL,振荡,静置10～15 min,加入蒸馏水,静置分层,取上清液进样分析。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行成分分析。

1.2.2.2 GC-MS条件 通过对色谱柱类型、分流比、程序升温条件的考察,结合实验室前期的实验条件,最终确定GC-MS条件。

GC条件:色谱柱为RTX-50石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);程序升温:初始温度120 ℃,保持10 min,以3 ℃/min,升温至230 ℃,保持10 min。进样口温度250 ℃,出样口温度200 ℃,检测电压350 V,载气氦气(纯度>99.999%),进样量1 μL,分流比20∶1,载气流速0.8 mL/min。

MS条件:EI离子源,电源温度200 ℃,电子能量70 eV,发射电流200 μA,质量扫描范围(m/z):20～550,检测器电压为1756 V。

1.2.3 体外抗氧化活性的测定

1.2.3.1 羟自由基清除率的测定 参考李姣等[14]的方法,在10 mL比色管中依次加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁和水杨酸-乙醇溶液,再加入用无水乙醇配制的浓度分别为0.05、0.08、0.2、0.4、0.5、0.8、1 mg/mL的昆仑雪菊油树脂样品(阳性对照:特丁基对苯二酚(TBHQ))各2 mL,用微型混合器混匀,最后加入2 mL 1%的过氧化氢,水浴30 min,在510 nm波长处测定吸光度(ΔA),然后根据下面公式计算清除率:

清除率(%)=[(ΔA0-ΔA)/ΔA0]×100

式中:ΔA0:不加样品的吸光度;ΔA:加入样品的吸光度。

1.2.3.2 DPPH自由基清除率的测定 参考Locatelli等[15]的方法,在10 mL比色管中依次加入用无水乙醇配制的浓度分别为0.2、0.4、0.5、1、1.6、2 mg/mL的昆仑雪菊油树脂样品(阳性对照:特丁基对苯二酚(TBHQ))各2 mL,再加入2.0 mL 2×10-4mol/L的DPPH·甲醇溶液,将混合溶液剧烈振荡1 min,在室温下避光放置30 min后,在517 nm波长处测定吸光度(Ai),然后根据下面公式计算清除率:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ai:样品液与DPPH·混合液的吸光度;Aj:样品液与无水乙醇混合液的吸光度;Ac:DPPH溶液与无水乙醇混合液的吸光度。

1.2.3.3 总还原力的测定 参考陈晋芳[16]、Baschieri等[17]的方法,在1 mL用无水乙醇配制的浓度分别为0.02、0.04、0.05、0.08、0.2、0.4、0.5 mg/mL的昆仑雪菊油树脂溶液中依次加入2.5 mL pH6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液,将混合溶液剧烈振荡1 min,并在50 ℃下放置20 min,加入2.5 mL 10% TCA溶液,混合振荡,从中吸取2.5 mL,加入等体积的蒸馏水和0.1% FeCl3溶液,振荡混匀,静置10 min,最后在700 nm波长处测定吸光度(A)。以无水乙酸作为空白对照,测吸光度A0。总抗氧化能力可以WA来表示:

WA=A-A0

式中:A0:不加样品的吸光度;A:加入样品的吸光度。

1.2.4 体内抗氧化活性的测定

1.2.4.1 动物实验 将健康雄性昆明种小鼠50只在饲养室适应性喂养3 d后,按体重随机分为5组,每组10只,即空白对照组NC、低剂量组LD(100 mg/(kg bw·d))、中剂量组MD(200 mg/(kg bw·d))、高剂量组HD(300 mg/(kg bw·d)),VC阳性对照组NC+(76 mg/(kg bw·d),空白对照组灌胃给予生理盐水,其余各组按设定剂量给药,灌胃体积为0.2 mL/(10 g bw),连续灌胃28 d。小鼠隔夜禁食,不限制饮水,在小鼠最后一次给药5 h后摘眼球取血,离心(3000 r/min,15 min),取血清,并4 ℃密闭环境保存。小鼠处死后,进行解剖取出脏器,立即称重[18]。

1.2.4.2 抗氧化活性指标的测定 小鼠处死后,立即在冰台上取肝脏、肾脏,以冰水混合的生理盐水洗去浮血,用滤纸吸干,用玻璃匀浆器制成组织匀浆,离心机离心(4 ℃,3000 r/min,10 min),分离上清液测定各项指标。同时摘出胸腺及脾脏,用滤纸吸干脏器表面血污,在-80 ℃下保存备用。

样品中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、总抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定;具体操作见试剂盒说明。

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 昆仑雪菊油树脂脂肪酸成分分析结果

由表1可知,昆仑雪菊油树脂含有四种不饱和脂肪酸,占脂肪酸总量的53.28%。其中亚油酸相对含量达到22.81%,其次为花生二烯酸12.34%,亚麻酸10.84%和油酸7.29%。月桂酸和己酸的相对含量较少,分别为1.59%和2.11%。医学研究表明,不饱和脂肪酸有明显降低高密度脂蛋白血清胆固醇的作用,进而减少高血压、心脏病及中风等的发病率[18]。亚麻酸对心血管疾病也有很好的防治作用[19],而亚油酸是人体必需的营养成分[20-21],这可能与昆仑雪菊的降血压、降血脂作用有关,其作用机理有待进一步的研究。

表1 昆仑雪菊油树脂脂肪酸GC-MS 分析结果Table 1 Results of GC-MS analysis offatty acids in the Kunlun chrysanthemum oleoresin

2.2 体外抗氧化活性分析

2.2.1 昆仑雪菊油树脂清除·OH能力 由图1可知,在所选浓度范围内,随着浓度的增大,昆仑雪菊油树脂及TBHQ对·OH的清除能力均增强。说明昆仑雪菊油树脂的·OH清除能力与浓度具有依赖性关系。当昆仑雪菊油树脂和TBHQ的浓度为1 mg/mL时,昆仑雪菊油树脂对·OH清除率为57.19%,而TBHQ对·OH的清除率则达到79.92%。昆仑雪菊油树脂对·OH的清除率整体低于TBHQ,TBHQ对·OH清除能力的IC50值为(0.2468±0.0711) mg/mL,而昆仑雪菊油树脂的IC50值为(0.7768±0.0675) mg/mL,低于TBHQ。这说明昆仑雪菊油树脂对·OH具有一定的清除能力,但清除能力弱于TBHQ。

图1 昆仑雪菊油树脂对·OH的清除能力Fig.1 Scavenging capacity of theKunlun chrysanthemum oleoresin on hydroxyl radical

2.2.2 昆仑雪菊油树脂清除DPPH·的能力 DPPH·是一种很稳定的氮中心的自由基,作为一种稳定的自由基,DPPH·可以捕获其他的自由基。因此,对DPPH·的清除效果可以反映抗氧化剂的供氢能力[22]。由图2可知,在所选浓度范围内,随着浓度的增大,昆仑雪菊油树脂对DPPH·的清除能力增强。TBHQ对DPPH·的清除率一直保持平稳的状态,但清除率都在80%以上。昆仑雪菊油树脂对DPPH·的清除率从0.5 mg/mL开始,其增高的速率逐渐变大,当昆仑雪菊油树脂的浓度达到2 mg/mL时,昆仑雪菊油树脂对DPPH·的清除率为85.46%,而TBHQ对DPPH·的清除率为95.89%。昆仑雪菊油树脂、TBHQ对DPPH·的IC50值分别为(0.8160±0.2219)、(0.0297±0.1248) mg/mL。可见,昆仑雪菊油树脂对DPPH·有一定的清除能力,但弱于TBHQ。

图2 昆仑雪菊油树脂对DPPH·的清除率Fig.2 Scavenging capacity of theKunlun chrysanthemum oleoresinon DPPH·

2.2.3 昆仑雪菊油树脂总还原力的测定 由图3可知,在0.02～0.5 mg/mL的浓度范围内,随着浓度的增加,TBHQ及昆仑雪菊油树脂的总还原力均增强。TBHQ的总还原力一直处在上升的趋势,而昆仑雪菊油树脂随着浓度的增大,其总还原力变化并不明显。TBHQ的总抗氧化能力远远强于昆仑雪菊油树脂。

图3 昆仑雪菊油树脂总还原力Fig.3 Total reduction capacity ofthe Kunlun chrysanthemum oleoresin

2.3 体内抗氧化活性分析

2.3.1 昆仑雪菊油树脂对小鼠体重的影响 由表2可知,低剂量组LD、中剂量组MD、高剂量组HD灌胃前后小鼠体重增量分别为10.20、7.76、7.76 g,与空白对照组NC灌胃前后体重增量10.66 g相比,均没有显著性差异(P>0.05),说明昆仑雪菊油树脂的灌胃剂量对小鼠体重影响不显著。

表2 灌胃前后小鼠体重变化Table 2 Changes in body weight in mice before and after intragastric administration

2.3.2 小鼠血清SOD活力、MDA含量和总抗氧化能力 超氧化物在超氧化物歧化酶(SOD)的催化作用下转化为氧气和过氧化氢,能清除超氧阴离子自由基。丙二醛(MDA)在体内是自然生成的,是氧化应激的标志物,MDA增加越多可以间接地反映机体细胞受到自由基攻击的程度越大。总抗氧化能力(T-AOC)反映了机体酶促反应体系和非酶促反应体系总的抗氧化水平[23-25]。因此,当肝脏受到损伤时,SOD活力、总抗氧化能力都有不同程度地降低,而MDA的含量有一定程度地升高。由表3可知,阳性对照组(VC)的SOD活力强于空白对照组,差异性极显著(P<0.01),低剂量组的SOD活力与空白对照组相比没有显著性差异,而中、高剂量组差异性均显著(P<0.05)。阳性对照组(VC)的MDA含量低于空白对照组,差异性极显著(P<0.01),低剂量组血清中MDA含量低于空白对照组,中、高剂量组均达到极显著水平(P<0.01)。阳性对照组(VC)的总抗氧化能力强于空白对照组,低、中和高剂量组的总抗氧化能力与空白对照组相比没有显著性差异,但均强于空白对照组。

表3 昆仑雪菊油树脂对小鼠血清中SOD、MDA与T-AOC的影响结果Table 3 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse serum

并且正常小鼠血清中SOD、总抗氧化能力的增强和MDA含量的降低均与昆仑雪菊油树脂的浓度成依赖性关系。因此,昆仑雪菊油树脂对小鼠血清中的SOD活力、总抗氧化能力有增强的作用,对MDA的含量有降低的作用,说明昆仑雪菊油树脂具有抗氧化能力,且浓度越大,抗氧化能力越强。

2.3.3 小鼠肝脏SOD活力、MDA含量和总抗氧化能力 如表4所示,阳性对照组(VC)的SOD活力强于空白对照组,差异性显著(P<0.05),低剂量组SOD活力与空白对照组相比没有显著性差异,而中剂量组SOD活力与空白对照组相比差异性显著(P<0.05),高剂量组SOD活力与空白对照组相比差异性极显著(P<0.01)。阳性对照组(VC)的MDA含量低于空白对照组,差异性显著(P<0.05),低剂量组MDA含量低于空白对照组,差异不显著,中、高剂量组均达到显著水平(P<0.05)。阳性对照组(VC)的总抗氧化能力强于空白对照组,差异性极显著(P<0.01),低、中剂量组的总抗氧化能力与空白对照组相比均没有显著差异,高剂量组的总抗氧化能力与空白对照组相比差异性显著(P<0.05),且均强于空白对照组。并且正常小鼠肝脏中SOD活力、总抗氧化能力的增强和MDA含量的降低均与昆仑雪菊油树脂的浓度成依赖性关系。因此,昆仑雪菊油树脂对小鼠肝脏中SOD活力、总抗氧化能力有增强的作用,对MDA的含量有降低的作用,说明昆仑雪菊油树脂具有抗氧化能力,且浓度越大,抗氧化能力越强。

表4 昆仑雪菊油树脂对小鼠肝脏中SOD、MDA与T-AOC的影响结果Table 4 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse liver

2.3.4 小鼠肾脏SOD活力、MDA含量和总抗氧化能力 由表5可知,阳性对照组(VC)的SOD活力高于空白对照组,差异性极显著(P<0.01),低剂量组SOD活力与空白对照组相比没有显著性差异,而中剂量组差异性显著(P<0.05),高剂量组差异性极显著(P<0.01)。阳性对照组(VC)的MDA含量低于空白对照组,差异性不显著。低、中和高剂量组的MDA含量与空白对照组相比没有显著差异,但含量均高于空白对照组。阳性对照组(VC)的总抗氧化能力强于空白对照组,差异性显著(P<0.05),低剂量组总抗氧化能力低于空白对照组,但差异不显著,中、高剂量组均达到显著性水平(P<0.05)。并且正常小鼠肾脏中SOD活力、总抗氧化能力的增强和MDA含量的降低均与昆仑雪菊油树脂的浓度成依赖性关系。因此,昆仑雪菊油树脂对小鼠肾脏中SOD活力、总抗氧化能力有增强的作用,对MDA的含量有降低的作用,说明昆仑雪菊油树脂具有抗氧化能力,且浓度越大,抗氧化能力越强。

表5 昆仑雪菊油树脂对小鼠肾脏中SOD、MDA与T-AOC的影响结果Table 5 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse kidney

3 结论

昆仑雪菊油树脂脂肪酸成分分析结果表明:昆仑雪菊油树脂共检测出了12种脂肪酸,有4种不饱和脂肪酸,占脂肪酸总量的53.28%,其中亚油酸的相对含量达到22.81%、其次为花生二烯酸12.34%、亚麻酸10.84%和油酸7.29%。体外抗氧化实验结果表明:昆仑雪菊油树脂具有体外抗氧化活性,对·OH及DPPH·均有较强的清除能力,且呈剂量依赖性。昆仑雪菊油树脂对·OH、DPPH·的IC50值分别为(0.7768±0.0675)、(0.8160±0.2219) mg/mL。体外抗氧化活性与特丁基对苯二酚(TBHQ)相比较弱。体内抗氧化实验结果表明:昆仑雪菊油树脂可使血清、肝脏和肾脏实验组中SOD活力与空白对照组相比时明显上升,其中高剂量组血清中的SOD活力差异性显著(P<0.05),肝脏和肾脏中SOD活力差异性均极显著(P<0.01);MDA含量与空白对照组相比下降,其中血清中的MDA含量差异性极显著(P<0.01),肝脏中MDA含量差异性显著(P<0.05);总抗氧化能力与空白对照组相比增强,其中肝脏和肾脏中差异性均显著(P<0.05)。因此,昆仑雪菊油树脂可以增强受试动物的抗氧化能力,具有良好的体内抗氧化作用。