银杏叶总黄酮超声辅助提取条件优化及其清除羟自由基能力

闫旭宇1,2,李 玲

(1.延安大学生命科学学院,陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心,陕西延安 716000; 2.湖南科技学院化学与生物工程学院,湖南永州 425199)

银杏(GinkgobilobaL.)为银杏科银杏属植物,在我国绝大部分地区均有分布。我国为世界银杏的主产地[1]。银杏叶的活性成分包括黄酮、萜内酯、银杏酸等主要成分,以及蛋白、多糖、维生素等其他物质[1-2]。其中,黄酮和萜内酯是发挥药效的主要成分,具有抗氧化、抑制血小板活化因子、扩张血管、调血脂等药理作用,在临床上用来治疗血栓、炎症和心血管疾病[3-4]。我国拥有世界70%以上的银杏资源,可见,开发与利用银杏叶资源意义重大。

目前,从银杏叶中已鉴别出40多种黄酮类化合物。由于黄酮类化合物大多都含有游离羟基,易溶解于极性较大的有机溶剂[5],有机溶剂提取法是常用提取方法之一。尤其是有机溶剂乙醇无毒且易回收,乙醇浸提法是当前国内外采用最广泛的提取银杏叶总黄酮的方法,得率在2%左右[5]。虽然乙醇浸提法操作简单,但其存在得率偏低、耗时费材料等缺陷,研究发现采用微波、超声波、加酶等辅助手段可以明显提高得率[6-8]。利用超声波破坏植物的细胞壁,提高溶剂进入细胞的速度,缩短提取时间,提高活性成分溶解率和得率[5,9]。同时,黄酮类化合物含有的游离羟基结构决定了其较强的捕获活性氧等自由基的能力,可作为一种天然安全有效抗氧化剂,减轻过量自由基对机体的损害,进而降低心血管疾病、糖尿病、肿瘤等多种疾病及其并发症的发生[10-11]。因此,在考虑成本情况下,采用超声辅助乙醇提取银杏叶总黄酮,有助于提高黄酮得率。

本研究以银杏叶为材料,以总黄酮得率为指标,利用超声辅助乙醇提取银杏叶总黄酮,用响应面设计优化银杏叶总黄酮的提取工艺条件,并初步研究总黄酮对羟自由基的清除作用,以期为进一步开发利用银杏叶资源提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏叶 采自延安大学校园内,选取新鲜、健康、无病虫害的叶片;无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、氢氧化钠、水杨酸、过氧化氢、抗坏血酸 所用试剂均为国产分析纯,陕西和平化玻有限公司;芦丁标准品(HPLC≥98%) 上海一基生物试剂有限公司。

FW-100D型植物粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司;WG-71型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;AUX220型分析天平 日本岛津公司;KQ500B型超声波清洗仪 昆山超声仪器有限公司;RE-52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-DⅢ型循环水真空泵 巩义市予华仪器责任有限公司;UV-2600型紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏叶总黄酮的提取工艺流程 银杏叶→清洗→60 ℃烘干至恒重→粉碎→过筛(80目)→超声辅助乙醇回流提取(300 W)→提取两次合并粗提液→室温减压抽滤→滤液减压旋蒸→定容→提取液

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 以芦丁为标准品,在已配制好的不同浓度的标准溶液中,加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH溶液,发生显色反应[12]。以不加芦丁对照品溶液为参比,在510 nm处测吸光度,以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程y=12.816x+0.0053,R2=0.9981。

1.2.3 银杏叶黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定总黄酮[12]。根据回归方程计算出提取液中总黄酮的质量浓度,然后计算银杏叶中总黄酮的得率(%):

式(1)

式中:Y为总黄酮得率(%),C为提取液中总黄酮浓度(mg/mL),V为定容体积(mL),N为稀释倍数,M为称量的银杏叶粉末质量(g)。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 乙醇浓度的选择 准确称取2.0 g干燥的银杏叶粉末5份,分别按料液比1∶25 (g/mL)加入浓度为70%、75%、80%、85%、90%的乙醇,在70 ℃的条件下超声回流50 min,研究乙醇浓度对银杏叶总黄酮得率的影响。

1.2.4.2 料液比的选择 准确称取2.0 g干燥的银杏叶粉末5份,分别加入料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)的浓度为75%的乙醇,在70 ℃的条件下超声回流50 min,研究料液比对银杏叶总黄酮得率的影响。

1.2.4.3 提取温度的选择 准确称取2.0 g干燥的银杏叶粉末5份,分别加入料液比为1∶25 (g/mL)的浓度为75%的乙醇,分别在65、70、75、80、85 ℃的条件下超声回流50 min,研究提取温度对银杏叶总黄酮得率的影响。

1.2.4.4 提取时间的选择 准确称取2.0 g干燥的银杏叶粉末5份,分别加入料液比为1∶25 (g/mL)的浓度为75%的乙醇,在70 ℃的条件下超声回流30、40、50、60、70 min,研究提取时间对银杏叶总黄酮得率的影响。

1.2.5 响应面试验 在单因素实验基础上,以总黄酮得率为响应值,对影响总黄酮得率的乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间4个因素进行响应面优化试验,确定超声波辅助提取银杏叶总黄酮的最佳工艺条件。各因素的水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table ofresponse surface methodology

1.2.6 银杏叶总黄酮清除羟自由基试验 银杏叶总黄酮及VC对羟基自由基的清除率,采用水杨酸法[11]进行测定。其中,总黄酮浓度(mg/mL)是以总黄酮含量计算的。羟基自由基的清除率计算公式如下:

式(2)

式中,E为羟基自由基清除率(%),A0为空白对照液的吸光值,Am为加入黄酮后的吸光值,An为不加H2O2时黄酮的吸光值。

1.3 数据处理

采用响应面分析软件Design Expert V 8.0.6.1的Box-Behnken Design进行实验设计及数据分析,以及采用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析,数据表示为“平均数±标准差”形式。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度的确定 如图1可知,随着乙醇浓度的提高,银杏叶总黄酮得率逐渐增加,当乙醇浓度超过75%后,总黄酮得率缓慢增加,在80%时达到最高,之后总黄酮得率缓慢降低。由此表明,乙醇浓度高于适宜提取浓度不仅会增加其它脂溶性物质的溶出量,降低总黄酮的相对溶出量,而且提高了投料成本[13]。考虑到提取效果及成本,最终确定乙醇的适宜浓度为80%。

图1 不同乙醇浓度下总黄酮的得率Fig.1 The yield of total flavonoidsunder different ethanol concentrations

2.1.2 料液比的确定 由图2可知,随着提取液体积的增加,银杏叶总黄酮得率先升后降。在料液比为1∶25 g/mL时,总黄酮得率达到最大值;料液比为1∶35 g/mL时的得率略低于1∶20 g/mL时的得率,但高于1∶15 g/mL时的得率。由此表明,料液比为1∶25 g/mL时银杏叶总黄酮已经充分提取出来;继续增加提取液提高了其他物质的溶出,降低了总黄酮的相对比率。因此,料液比的适宜取值为1∶25 g/mL。

图2 不同料液比条件下总黄酮的得率Fig.2 The yield of total flavonoidsunder different material-to-liquid ratios

2.1.3 提取温度的确定 如图3可知,随着提取温度由65 ℃上升到80 ℃,银杏叶总黄酮得率直线上升,在80 ℃时得率最大,85 ℃时得率明显下降。这表明温度较低时,总黄酮溶出较慢,但高于80 ℃的温度时,不仅提取溶剂乙醇易挥发,而且会破坏部分黄酮物质的化学结构导致其降解,加之杂质溶出也会增多,导致总黄酮的提取效果降低[14]。故最终提取的适宜温度为80 ℃。需要指出的是提取温度水平的设定,单因素实验结果最佳温度是80 ℃,但是当温度为70和85 ℃时,得率相近,考虑到提取效果及成本,特选取70、75、80 ℃作为响应面试验温度的三个水平。

图3 不同提取温度下总黄酮的得率Fig.3 The yield of total flavonoidsunder different extraction temperatures

2.1.4 提取时间的确定 如图4可知,随着超声回流提取时间的延长,银杏叶总黄酮得率先升后降,在50 min时达到最大值,之后继续延长超声时间,总黄酮得率明显下降。这可能是由于超声回流提取超过一定时间,提取溶剂损失量增加,黄酮稳定性变差,同时引起其他物质溶出,使总黄酮含量相对下降[11,14]。故控制提取时间在50 min左右时,提取效果较好。

图4 不同超声时间下总黄酮的得率Fig.4 The yield of total flavonoidsunder different ultrasonic time

2.2 响应面设计优化分析

2.2.1 响应面试验设计与结果 在单因素实验结果基础上,以总黄酮得率为响应值,对影响得率的乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间四个因素进行响应面优化试验。各因素水平优化试验设计及结果见表2。

表2 银杏叶总黄酮提取响应面试验设计及结果Table 2 Design and experiment results of response surfacemethodology of total flavonoids extraction rate from Ginkgo biloba leaves

2.2.2 回归模型的建立与方差分析 基于响应面试验结果(表2),采用Design Expert 8. 0. 6软件进行多元拟合回归分析,得到以银杏叶总黄酮得率为响应值的四元二次回归模型方程:

Y=3.46+0.1A+0.087B+0.062C+0.057D+0.085AB+0.032AC+0.038AD+0.02BC+0.032BD-0.02CD-0.093A2-0.049B2-0.077C2-0.08D2。

由方程一次项可知,影响银杏叶总黄酮得率的因素顺序为:乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间。由回归模型方差分析结果(表3)可知,模型的P<0.0001,极显著,该模型有意义;失拟项P>0.05,不显著,说明模型与试验的差异值较小,由决定系数R2可知响应值的变化有93.97%来源于四个试验因素,回归模型拟合度良好,预测值与实测值之间相关性较好,试验误差较小,可很好的描述各因素与响应值之间的关系[15]。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

回归模型方差分析中一次项的PA、PB、PC、PD、PAB、PA2、PC2、PD2值均小于0.01,PB2小于0.05,说明四个因素的一次项和二次项、乙醇浓度和料液比的交互项均存在显著性,而因素间的交互项及失拟项显著性相对较差。表明四个因素对响应值总黄酮得率均存在显著影响,其关系是一种非线性关系[15-16]。

由方差分析可知,乙醇浓度和料液比的交互作用对银杏叶总黄酮得率影响达到极显著水平(P<0.01)。为更直观形象地说明其交互影响作用,利用Design Expert 8. 0. 6软件对交互项作响应曲面图和等高线图(图5)。可以看出,乙醇浓度和料液比相互作用的响应面曲面坡度较陡峭,等高线图基本呈扁平椭圆状,表明乙醇浓度和料液比交互作用较强,对银杏叶总黄酮得率的影响显著[15-17]。

图5 乙醇浓度和料液比对银杏叶总黄酮得率的交互影响Fig.5 Effect of interaction of ethanol concentrationand material-to-liquid ratio on total flavonoidsyield from Ginkgo biloba leaves

2.2.3 最佳提取条件的确定与验证 用Design Expert 8. 0. 6软件进一步分析回归方程,得出银杏叶总黄酮提取的最适条件为:乙醇浓度80.66%、料液比1∶25.58 g/mL、提取温度75.47 ℃、提取时间50.57 min,预测得率为3.606%。考虑到实际操作的局限性,提取工艺最终修正为:乙醇浓度81%、料液比1∶26 g/mL、提取温度75 ℃、提取时间51 min。此条件下进行试验验证,重复试验3次,银杏叶总黄酮实际得率为3.58%,与预测值(3.606%)接近,其相对误差为0.72%。本实验超声辅助乙醇提取银杏叶总黄酮的得率高于乙醇浸提法的得率2.20%[18],以及高于利用该法的张光辉等的得率2.82%[7],并且略高于霍银强等的得率3.51%[19],这可能是由于本实验中乙醇浓度81%高于张光辉等的75%,以及超声功率300 W高于霍银强等的100 W,相对较高的乙醇浓度和超声功率会导致短时间内总黄酮的最大溶出,以及与选取材料不同及总黄酮得率计算方法不同有关[20]。

2.3 银杏叶总黄酮对羟自由基的清除作用

银杏叶总黄酮对羟自由基(·OH)的清除结果见图6。银杏叶总黄酮和VC对羟自由基的清除率均随浓度的增加而逐渐增加,清除羟自由基能力与浓度存在一定的量效关系[11]。在相同浓度下,银杏叶总黄酮对·OH的清除率高于VC,说明银杏叶总黄酮具有一定的抗氧化能力。

图6 银杏叶总黄酮对羟自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability oftotal flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves

3 结论

本研究采用超声辅助乙醇提取银杏叶总黄酮,根据单因素试验结合响应面优化分析得到银杏叶总黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度81%、料液比1∶26 g/mL、提取温度75 ℃、提取时间51 min,银杏叶总黄酮得率为3.58%。由方差分析和因素间交互作用分析得出,四个因素对银杏叶总黄酮提取均有显著影响(P<0.05),顺序为:乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间,且乙醇浓度和料液比对银杏叶总黄酮得率的交互影响较强。本研究采用的超声辅助乙醇法可靠,适宜于在省时间、低耗能的条件下提取银杏叶总黄酮,并在提取时要优先考虑乙醇浓度和料液比对总黄酮得率的交互影响。在相同质量浓度下,本实验提取的银杏叶总黄酮对羟自由基的清除效果高于VC,具有较强的抗氧化活性,可以作为一种羟基自由基的天然清除剂进行开发应用。