药用植物川续断热激蛋白基因獺SP70和HSP90的鉴定与分析

陈杰 徐娇 张进强

摘要 为了解药用植物川续断中热激蛋白基因的分布情况及序列特征，以不同海拔川续断转录组数据库为基础，利用生物信息学方法鉴定和分析川续断HSP70和HSP90基因家族成员。结果表明，川续断中至少包含36个HSP70和18个HSP90基因，各成员在细胞质、细胞核、内质网中均有分布，15类保守基序长度介于15～50个氨基酸之间;系统进化树揭示DaHSP90基因与拟南芥亲缘关系更近。初步筛选了10个响应温度胁迫的热激蛋白基因，为进一步探索川续断HSP基因家族的功能奠定重要理论基础，同时也为研究影响其活性成分川续断皂苷Ⅵ含量因素提供参考。

关键词 川续断;热激蛋白;基因;鉴定;生物信息学

Abstract In order to understand the distribution and sequence characteristics of heat shock protein genes in D. asper，which was a medicinal plant， bioinformatics methods were used to identify and analyze the members of the DaHSP70 and DaHSP90 gene families based on transcriptome databases of D. asper at different altitudes. The results showed that a total of 36 HSP70 and 18 HSP90 genes were identified from D. asper. The members were distributed in cytoplasm， nucleus or endoplasmic reticulum. The length of 15 conserved motifs of family members ranged from 15 to 50 amino acids. Phylogenetic tree revealed that DaHSP90 was closer to Arabidopsis thaliana. In this study， ten heat shock protein genes were preliminarily screened. The results provided an important theoretical foundation to explore the function of HSP gene family and study the factors affecting the content of active ingredient asperosaponin Ⅵ in D. asper.

Key words Dipsacus asper;Heat shock protein;Gene;Identification;Bioinformatics

中药续断来源于川续断科川续断（Dipsacus asper Wall.ex Henry）植物的干燥根，药材具有行血消肿、生肌止痛、续筋接骨、安胎等功效，常用于治疗骨损伤、骨质疏松、腰膝酸软、习惯性流产等疾病[1]。2015版《中国药典》规定以川续断皂苷Ⅵ作为续断药材的质量评价指标。原植物川续断喜寒、忌高溫[2]，常见于海拔700～1 500 m的山地或林缘的草丛中，有较强的环境适应性。研究发现[3]，川续断皂苷Ⅵ含量变化与海拔呈正相关，在实际人工种植生产中亦采取高海拔育苗、低海拔栽培方式。海拔作为重要的环境因子，包含光、温、水等气候条件因子，其中温度是影响较大的因子之一，在一般情况下，海拔越高，温度越低[4]。因此，推测川续断中川续断皂苷Ⅵ合成积累与温度相关。

热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是生物体遭遇高温胁迫时，迅速并大量产生的一类蛋白，是生物适应环境温度变化的一个重要媒介。HSPs既是植物的防御蛋白又是必需蛋白，普遍存在于生物体中，具有高保守性、短时性、种类丰富等特点[5]。在不同生命进程中，热激蛋白有组装、转运和降解蛋白等功能，对稳定蛋白结构和膜系统，维持植物正常生长发育有着重要的作用[6]。随着地球温室效应的加剧，植物的耐热性研究也越来越受到人们的关注。据报道，在拟南芥、水稻[7]、玉米[8]等多种植物中均发现存在热激反应且伴有HSPs的产生，同时也证实热激蛋白不仅受高温诱导，在高盐、干旱、过氧化、重金属离子等胁迫下也可瞬间大量表达[9]。HSPs种类繁多，通常分为5个家族（HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子sHSP），每个家族都是超基因家族。其中HSP90和HSP70是研究最多的两大家族，深入研究该蛋白有利于新种质资源的创新。迄今，利用转录组数据挖掘川续断热激蛋白的研究鲜见报道。因此，该研究通过进一步挖掘川续断转录组数据，对获得的热激蛋白基因序列进行生物信息学分析，旨在全面了解川续断热激蛋白基因HSP70和HSP90的基本性质、系统进化及功能作用等信息，为开展川续断热激蛋白的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所选材料来源于贵州省威宁县（海拔1 000～2 500 m，26°31′24″N，108°17′37″E），于1 000、2 350 m处采集一年生川续断植株，由贵州中医药大学生药学教研室江维克教授鉴定，提取川续断根的总RNA，设置3个生物学重复，送往上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序分析，转录组从头拼接获得131 311个转录本，包含58 925个unigene，其中，40 000多个unigenes分别被Nr、Swissprot、Pfam、GO、COG、KEGG数据库比对注释成功。

2.6 系统进化分析

以不同物种中的HSP70和HSP90蛋白序列构建进化树，系统发育树显示，川续断热激蛋白在每个大支上均有分布，其中DaHSP70-17/22/28/30与酵母菌YDL229W_YS9聚为一亚支，DaHSP70-14/32与水稻Os12g38180.1聚为一亚支，DaHSP70-2/3与拟南芥At3G12580.1聚为一亚支（图3A）。DaHSP90-13与酵母菌聚为一亚支，DaHSP90-4/7/10与拟南芥亲缘关系更近（图3B）。综上所述表明，DaHSP70和DaHSP90与拟南芥、水稻等物种中的热激蛋白亲缘关系存在较大的差异。进化关系上归为一类的热激蛋白基因在功能上可能较为相似，因此可以结合模式植物中已知功能的HSP基因和进化亲缘关系，推测川续断DaHSP70和DaHSP90基因的功能。

2.7 基因家族表达分析

根据已完成的川续断转录组数据库，找出筛选出的54个HSP基因相应的表达量，均一化处理后作图。从图4可以看出，不同基因有其独特的表达模式，同时也有其表达共性。低海拔与高海拔相比，在高海拔中，表达量变化大的基因有DaHSP70-2、DaHSP70-16、DaHSP70-31、DaHSP90-4、DaHSP90-7、DaHSP90-8、DaHSP90-12、DaHSP90-14、DaHSP90-15、DaHSP90-18，推测以上这10条基因编码的蛋白属于诱导型热激蛋白，主要响应低温调控的。

3 讨论与结论

随着高通量測序技术的不断发展和完善，其技术应用于转录组水平上也越来越普遍，且非常适合基因组尚未完成及遗传数据匮乏的物种。目前，已经从多个植物中鉴定出HSP70和HSP90的同源基因[10-12]，它们都是以基因家族形式存在。该研究在川续断中共鉴定出36个DaHSP70和18个DaHSP90基因，根据亚细胞定位，DaHSP70和DaHSP90编码蛋白有4种类型，包括细胞质型、内质网型、细胞核型、叶绿体/线粒体型，其中细胞质型为主要，与已研究的拟南芥、水稻主要定位在细胞质中一致[2]。

不同物种相同细胞器的同源性大于同一物种不同细胞器，叶用莴苣、拟南芥、番茄等细胞质型HSP70氨基酸的同源性达80%[9]。该研究发现，在拟南芥、水稻和川续断中细胞质型HSP70和HSP90氨基酸的同源性达70%～80%。HSP70和HSP90蛋白序列的N端和C端分别具有ATPase区和多肽结合区，不同之处在于HSP70蛋白序列末端是8个氨基酸残基（GPTIEEVD），而HSP90蛋白序列末端是五肽结构（MEEVD）。该研究结果显示，在川续断中，细胞质型蛋白序列亦有以上结构，表明HSP70和HSP90基因家族成员在川续断中同样高度保守。系统进化结果显示，每大支均有不同物种的热激蛋白家族成员，且分布不均，进一步表明HSP70和HSP90基因家族成员之间存在广泛的多样性。在拟南芥中细胞质型HSP90基因响应氧化胁迫[13]，该研究发现DaHSP90基因家族成员与拟南芥亲缘关系更近，推测DaHSP90基因家族中编码的同类型蛋白参与川续断逆境下的氧化胁迫。

热激基因的表达调节主要在转录水平，在川续断转录组中，DaHSP70-2、DaHSP70-16等10个基因在高海拔中的表达量明显较低海拔高或低，由此推测它们编码的蛋白为诱导型蛋白，响应低温胁迫。基因的表达与基因功能密切相关。在黄瓜幼苗中，通过上调HSP70，减少植株体内H2O2的积累，从而提高耐热性，而HSP90不仅具有效提高干旱能力，还具有缓冲作用，当生物遇到胁迫时，会暴露存在的隐藏突变，有助于植物的进化适应[14]。推测以上10个热激蛋白在川续断抗逆作用中发挥主要作用。川续断中活性成分川续断皂苷Ⅵ含量与生长环境温度有一定的关联，因此，亦可以作为后期筛选影响川续断皂苷Ⅵ合成积累的候选基因。

该研究基于转录组水平的鉴定从川续断中筛选获得36个DaHSP70基因和18个DaHSP90基因，并对其进行相关生物信息学和表达特征分析，为深入研究DaHSP基因家族在川续断中的相关功能奠定坚实的基础。

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