EMS诱变NC 55突变体库的创建及高钾突变材料的筛选

孙计平， 娄亚楠， 孙 焕， 李雪君， 陈 飞， 平文丽， 丁燕芳

(河南省农业科学院烟草研究所/黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室， 河南 许昌 461000)

钾是所有植物的必需营养元素，钾含量是烟叶品质评价的重要指标之一[1]。钾参与糖类、脂类和蛋白质的代谢过程，钾能改善烟叶品质，降低焦油含量，同时还能增强烟株的抗病、抗逆能力，含钾量高的烟叶色泽好，香气足，有弹性和韧性，阴燃持火力和燃烧性好[2]。目前国际上优质烟叶含钾量要求达到2.5%以上，而我国烟叶含钾量多数不足2%，河南、山东、陕西、山西烟区的烟叶含钾量多数小于1.5%，甚至少数在l%以下，烟叶钾含量低是制约烟叶品质提升的重要因素[3]。烟草的吸钾能力和烟叶含钾量在基因型间存在着明显差异，且钾积累效率可通过遗传操作进行稳定遗传[4]，通过培育钾高效品种，提高烟叶钾含量，能从根本上改变烟叶钾含量低的现状。目前烟草品种选育主要采用杂交育种、系统选育和诱变育种等方式。

甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)是目前公认的应用最广泛且效果较明显的一种高效、稳定的化学诱变剂[5]。EMS诱变成本低，诱变效果具有较高的转移性，破坏性小，诱变频率高。通过EMS诱变建立突变体库，既是对种质资源的创新，又是挖掘新基因的强有力工具，加速育种进程的同时也推动功能基因组学的发展[6]。目前，EMS诱变已经在多种作物育种中取得显著成就，如小麦[7]、水稻[8]、花生[9-10]、大豆[11-12]等。EMS诱变有利于等位基因突变体的获得，只需要较小的突变群体便可以获得饱和的突变体库，在烟草品种PVY抗性[13]、抗干旱[14]、抗主要病虫害突变体的鉴定方法[15]等方面的也取得了较大进展。本研究通过EMS诱变处理优质烤烟品种“NC 55”，建立突变体库，筛选高钾突变体及其它特殊材料，对烟草品种选育和烟草功能基因定位研究有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为烤烟品种NC 55。

1.2 试验方法

1.2.1烟草EMS突变体的创制

参考刘贯山等[6]主编的《烟草突变体》中EMS诱变烟草种子方法，采用0.6%EMS诱变处理烤烟品种NC 55裸种。将处理好的种子进行发芽实验，记录发芽率，0.6%EMS处理后致死率为51%。

1.2.2突变体观察和M1代单株留种

EMSNC 55在河南省农业科学院烟草研究所育苗大棚育苗，采用漂浮育苗方式进行，成苗后按照优质烟叶栽培规程进行大田种植。田间观察诱变M1代表型，典型单株拍照，单株留种。

1.2.3高钾突变材料筛选

旺长期根据表型初筛烟叶钾含量高的单株，并挂盘标记，选择依据一是烟叶颜色深的，二是雨后或灌水后出现焦尖的单株。成熟期单株采收中部叶片，105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒重，粉碎，采用火焰光度计法测定叶片钾含量[16]，以未进行EMS诱变处理的烤烟品种NC 55作为对照。

图1 多头突变表型

图2 叶片畸形突变表型

2 试验结果

2.1 EMSNC 55 M1伸根-团棵期表现

大田种植EMSNC 55 M1代1 280株，与NC 55相比较，EMSNC 55 M1代突变株系较多，伸根到团棵期观察，突变株系共计152株，突变率为11.88%。最典型的三类突变株系如下：a.多头突变(图1)；b.叶片畸形(图2)；c.叶形突变(图3)。多头突变最多，共计68株，占5.31%；其次为叶片畸形，共计50株，占3.91%；叶形突变也较多，包括叶片变窄16株，占1.25%；叶片变宽10株，占0.78%；披针形叶6株，占0.47%。多头突变也同时伴随叶片畸形等突变发生，突变株统计不重复计算，但各类型突变株有交叉统计。

叶面变皱突变和叶色突变见图4，叶面变皱的共计10株；叶色突变的13株，其中叶色变深的9株，局部叶片黄化的4株。

主脉分支突变体、叶片分叉突变体、有叶柄突变体见图5，此外还有叶面变光滑突变体、叶色变浅突变体、主脉变白突变体等。

2.2 EMSNC 55 M1旺长-现蕾-开花期突变体

从旺长-现蕾-开花期表现来看，与NC 55亲本相比较，EMSNC 55 M1代突变株系较多，类型丰富，随着烟叶生长和株高增加，叶形突变更加明显，株高和花的突变也非常明显。典型叶片突变见图6，株高突变见图7，株型突变见图8，花突变见图9。

图3 叶形突变表型

图4 叶色和叶面突变表型

图5 叶脉和叶柄突变表型

图6 旺长期叶片突变表型

图8 螺旋株型突变表型

图9 花变异突变体

2.3 高钾突变材料筛选

根据旺长期观察，初步筛选到152份高钾突变材料，成熟期取样测定烟叶钾含量，烟叶钾含量高于对照NC 55的有74份(表1)，其中N 5501烟叶钾含量最高，为2.03%；烟叶钾含量超过1.50%的有35份。

3 讨 论

创制并鉴定突变体是研究植物基因功能最有效的途径，也是作为改良的重要途径[17]。烟草是我国重要的经济作物，尤其是烤烟，但品种单一、种植年限过长且遗传背景狭窄[18]，急需拓宽遗传背景，培育优质新品种。烤烟品种NC 55是美国培育的优质品种，20世纪从巴西引入中国，抗黑胫病[19]、PVY[20]和根结线虫病[21]，引入后作为种质资源和亲本使用。

EMS是一种能改变DNA结构的烷化剂，影响mRNA的转录，使得蛋白质重组，进而改变表型性状，EMS诱变染色体畸变相对较少[22]，主要是点突变，突变性状多为显性基因控制，易于筛选。因此被广泛用于作物的突变群体构建，中国农业科学院烟草研究所利用EMS化学诱变方法，分别建立了中烟100 EMS诱变突变体库、“红花大金元”EMS诱变突变体库、“翠碧一号”EMS诱变突变体库、林烟草EMS诱变突变体库，获得EMS诱变M2代种子近12万分，分别对外观形态、优质、抗病、抗逆性等进行了筛选和分析，获得了700多个突变体的系谱和性状，对部分基因突变位点进行了分析[6]。

表1 高钾突变体

样品编号钾含量/%N55012.03N63041.81N41021.80N40091.79N27101.72N28051.70N51141.67N45101.67N37101.66N16021.65N54031.64N37081.64N31141.62N32141.62N31161.61N56161.61N40121.60N06081.59N61161.59N64041.59N26131.57N41031.57N46151.56N60151.56N62181.56样品编号钾含量/%N62201.56N40051.55N64161.55N43171.55N37031.54N47021.54N240131.54N17051.52N19051.50N30121.50N04161.49N48051.49N11131.49N26161.49N44101.49N42101.48N63161.48N57131.46N32121.45N32041.44N41151.44N49181.43N37111.42N57081.42N06031.42样品编号钾含量/%N39131.42N47051.41N60031.41N23141.39N54071.38N11121.36N57101.36N04051.36N38151.35N42131.34N51201.34N32051.33N51041.33N38161.33N64091.31N42191.31N13151.31N06161.28N34121.28N37141.25N09061.25N13201.23N60041.19N64201.18NC551.18

采用EMS诱变NC 55，建立NC 55 EMS诱变突变体库，不仅有利于拓宽种质资源遗传背景，创制新种质及品种培育和改良，还有利于烟草功能基因鉴定及研究基因序列与功能的关系，从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。从NC 55 EMS诱变M1代表型来看，突变体变异丰富，突变率为11.88%，其中多头突变最多，其次为叶片畸形和叶形突变、株高突变和株型突变；还有少量叶柄、主脉、叶色、叶面和叶缘突变等。EMSNC 55 M1代单株留种606份，为进一步筛选各种类型突变体和选育新品种创建了很好的突变体库。

烟草是喜钾作物，钾与烟草的抗逆性、抗病虫害能力密切相关，也是烟草品质评价的重要指标之一[23]。基于钾素的重要性和我国土壤普遍低钾的国情及国内烟叶钾含量低的现状，筛选钾吸收高效型品种工作极为迫切[24]。中国农业科学院烟草研究所从6 000余份烟草EMS诱变中烟100突变体中，获得耐低钾突变体材料7份[6]。本研究通过大田筛选和烟叶钾含量化验，初步筛选到烟叶钾含量较高的突变材料35份，单株留种，获得M2代种子，以备进一步鉴定。

本研究构建了EMSNC 55突变体库，并对表型突变和钾含量突变进行了初步分析，筛选的高钾突变株还有待于进一步验证；其它突变材料筛选和鉴定以及相关研究还需要进一步继续进行。