淋巴细胞VCS参数辅助诊断活动性肺结核的临床应用研究*

张峰领,袁 涛,王 静,孙婷婷,邓少丽△

(陆军军医大学大坪医院：1.检验科；2.肝胆外科，重庆 400042;3.重庆市公共卫生医疗救治中心检验科，重庆 400036)

结核病是结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病。据世界卫生组织统计，2017年大约有1 000万例新发结核病，157万结核病患者死亡。而人群中1/3均为结核杆菌感染者，其中5%～10%会发展为活动性结核[1-3]，我国是排在印度之后的第二大结核病高负担国，面临的结核病防控形势非常严峻，缺乏有效的诊断方法是困扰结核防控的重要原因。现有的结核相关实验室检查如抗酸染色法、分离培养法是实验室诊断金标准，但存在着阳性率低、检测时间长等缺陷，结核菌素试验假阳性、假阴性都较高，γ干扰素释放试验对结核杆菌感染具有较高的灵敏度和特异度，但不能区分潜伏性结核和活动性肺结核[3-6]，因此，临床上迫切需要辅助诊断活动性肺结核的新指标。血液分析仪的VCS技术通过检测细胞体积(Volume)、导电率(Conductivity)、多个角度的光散射(Scatter)，能准确、快速地对8 000个白细胞的形态做全面评价[7-10]。有研究发现[11-13]，在病毒性感染性疾病及淋巴细胞相关白血病中，淋巴细胞VCS参数可发生明显改变，目前笔者查阅文献尚未见淋巴细胞VCS参数在结核诊断中的研究。本研究分析淋巴细胞VCS参数的变化，以评估其在活动性肺结核诊断中的应用，包括高中角度光散射(UMALS)、中角度光散射(MALS)、低中角度光散射(LMALS)、低角度光散射(LALS)检测细胞颗粒度和膜形貌轴向光损耗测量(AL2)，分析细胞透明度。同时获得与细胞形态直接相关的3个形态参数对白细胞进行检测分析。在三维空间里，对细胞体积、大小、颗粒度多少进行全方位检测获得一系列参数，准确、快速地对白细胞内部、外部形态进行全面评价[14]。机体受到结核分枝杆菌感染后，淋巴细胞会被激活并释放细胞因子抑制结核分枝杆菌[15]，其细胞体积大小及导电率也会发生相应的变化。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年7月至2018年6月重庆市公共卫生医疗救治中心及陆军军医大学大坪医院活动性肺结核患者97例，潜伏性结核113例，体检健康者101例(健康对照组)，对其淋巴细胞VCS参数进行检测。根据中华人民共和国卫生行业肺结核诊断标准(WS 288—2017)，活动性肺结核患者纳入标准：痰培养、痰抗酸染色、分子诊断至少有1个阳性[15]，胸部X线片表现符合结核病影像学病变，所选病例均无抗结核药物治疗史。潜伏性结核患者纳入标准：γ-干扰素释放试验阳性，痰涂片和结核分枝杆菌培养均阴性，无结核病的相关临床症状[16]。健康对照纳入标准：无结核患者接触史，胸部X线片表现正常，结核感染T细胞斑点检测(T-SPOT.TB)实验阴性，肝功、肾功、乙型肝炎、血常规检查均正常。排除标准：年龄<18岁、孕妇、HIV病毒感染、癌症、自身免疫性疾病患者，正在接受免疫抑制剂或已接受抗结核治疗者均不入选。

1.2仪器与试剂 UniCel Coulter DxH800全自动血液分析仪及原装配套试剂和质控品(美国Beckmanculter公司)；T-SPOT.TB 试剂盒(英国Oxford Immunotec公司)；RPM1640 细胞培养液(中国天津灏洋生物制品科技有限公司)；人全血淋巴细胞分离液和AIM-V®Medium CTS®(AIM-V)培养液(中国天津太平洋生物科技股份有限公司)。所用实验耗材均需高压灭菌、干燥后才使用。

1.3方法

1.3.1VCS参数分析 各研究对象均抽取外周静脉血3 mL于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)真空采血管，立即颠倒混匀，所有样本在采集后4 h内完成检测，使用UniCel Coulter DxH800血液分析仪配套试剂和质控品，标本无凝血及溶血。检测项目包括白细胞计数(WBC)、淋巴细胞百分比(LY%)、淋巴细胞VCS参数。VCS参数包括淋巴细胞平均体积(MLV)、淋巴细胞平均体积标准差(MLV-SD)、淋巴细胞平均导电率(MLC)、淋巴细胞平均导电率标准差(MLC-SD)、UMALS、UMALS标准差(UMALS-SD)、MALS、MALS标准差(MALS-SD)、LMALS、LMALS标准差(LMALS-SD)、LALS、LALS标准差(LALS-SD)、AL2、AL2标准差(AL2-SD)。

1.3.2T-SPOT.TB 实验和结果判读 各研究对象使用肝素钠真空采血管抽取4～8 mL外周静脉全血，按照试剂说明书，每份标本设置2个检测孔和2个质控对照孔，分别为特异性抗原A检测孔(加入ESAT-6溶液50 μL)、特异性抗原B检测孔(加入CFP-10溶液50 μL)、阳性质控对照孔(加入PHA 50 μL)、空白对照孔(加入AIM-V 50 μL)，每孔加入按照说明书配置的标准细胞液100 μL。加样后将培养板放在37 ℃含%CO2培养箱孵育16～20 h。用200 μL新鲜准备的无菌PBS洗板4次。拍干后每孔加入酶标抗体50 μL(1∶200倍稀释)，置2～8 ℃冰箱孵育1 h。取出后再次PBS洗板，拍干后每孔加入显色液50 μL，室温避光反应7 min，以蒸馏水终止反应。置于37 ℃，5% CO2孵箱2～3 h或室温过夜干燥培养板，使用显微镜、放大镜或自动计数仪检测孔内结合在底膜上的特异性斑点数(清晰的紫色斑点、中间色深、周围有浅色晕的点)。结果判读：(1)判读为“有反应性”(阳性)，见于①空白对照孔斑点计数为0～5个时且抗原A(或B)孔的斑点数减去空白对照孔的斑点数后，数值≥6；②空白对照孔斑点数为6～10个时且抗原A(或B)孔的斑点数≥2倍空白对照孔斑点数。(2)判读为“无反应性”(阴性)，见于不符合(1)的标准且阳性质控对照孔正常时检测结果为“无反应性”。

2 结 果

2.1肺结核患者中淋巴细胞VCS参数的变化 活动性肺结核组97例，年龄21～80岁，平均(49.800±14.500)岁，男性53例，女性44例；潜伏性结核组113例，年龄21～77岁，平均(50.200±17.700)岁，男性48例，女性65例；健康对照组101例，年龄19～82岁，平均(15.900±19.100)岁，男性51例，女性50例。3组在年龄、性别上差异无统计学意义(P>0.05)。

淋巴细胞VCS参数的MLV、MLV-SD、MLC-SD、MALS-SD、UMALS-SD、LMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD及LALS在活动性肺结核组显著高于潜伏性结核组和健康对照组(P<0.05)，但MALS、LMALS在活动性肺结核组明显低于潜伏性结核组和健康对照组(P<0.05)，淋巴细胞VCS参数的所有指标在潜伏性结核组与健康对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2淋巴细胞VCS参数诊断活动性肺结核的灵敏度与特异度 根据约登指数选择最佳临界值，即ROC曲线上所有点的灵敏度和1-特异度之间差异最大时所取数值。进行多指标联合诊断时，有任何一项为阳性即可判断为阳性结果。通过对淋巴细胞VCS参数区分活动性肺结核与潜伏性结核感染的灵敏度与特异度分析，MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD获得比其他参数更高的曲线下面积，分别为0.775、0.900、0.802、0.860、0.785，见表2。同时测量MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD可获得曲线下面积高达0.920，并且其区分活动性肺结核与潜伏性结核感染的灵敏度和特异度分别为79.40%和92.90%。见表2、图1。

表1 3组淋巴细胞VCS参数的变化

注：P1表示活动性肺结核组与潜伏性结核组比较；P2表示活动性肺结核组与健康对照组比较。

表2 淋巴细胞VCS参数诊断活动性肺结核的灵敏度和特异度

注：-表示无数据。

图1 淋巴细胞VCS参数ROC曲线

3 讨 论

结核病位列传染病死因第1位，缺乏有效的诊断方法是其重要原因之一。γ干扰素释放实验可有效诊断结核感染，但不能有效区分活动性肺结核与潜伏性结核。人体受到结核分枝杆菌感染后会启动巨噬细胞和致敏的淋巴细胞参与免疫反应，激活的T淋巴细胞释放出γ干扰素、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素12等细胞因子抑制结核杆菌的生长[17]，淋巴细胞形态在抗结核免疫过程中发生明显的改变。本研究通过DxH800血液分析仪的VCS技术直接对活动性肺结核患者外周血中淋巴细胞的形态特征进行检测，结果证实活动性肺结核组中MLV、MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD显著高于潜伏性结核组和健康对照组。这些变化提示结核感染后，激活的淋巴细胞体积增大，体积异质性增加。细胞核/细胞质比例偏高(核幼稚程度更高)，部分淋巴细胞参与抗结核免疫反应，细胞质内颗粒增多，膜形态等发生显著改变，这与本研究结果相吻合，细胞受到结核分枝杆菌感染后，MLV及MLV-SD与潜伏性结核感染相比，明显增大。MLC虽然没有变化，但其MLC-SD已经提示细胞存在异质性，由于受感染细胞被激活，分泌各种细胞因子，细胞质内颗粒增多，从而导致细胞各角度的光散射不同程度地在活动性肺结核组与潜伏性结核组、健康对照组间有显著的差异，其异质性如UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD明显增加。并且通过ROC曲线分析显示，MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD 的曲线下面积均达0.800以上，同时测量这5个参数，获得曲线下面积高达0.920，灵敏度为79.40%，特异度为92.90%，可以作为潜在的参考指标用于辅助诊断活动性肺结核，且该指标可用于区分活动性肺结核与潜伏性结核。

研究提示，在脓毒血症、菌血症等细菌性感染中，中性粒细胞VCS参数发生显著变化[18-20]，结核感染主要通过激活巨噬细胞和淋巴细胞发挥抗结核免疫作用，本研究结果提示淋巴细胞参与抗结核免疫，其细胞体积及内部结构、所含颗粒均在结核病患者与健康人群中差异显著，淋巴细胞VCS参数可区分活动性肺结核和潜伏性结核感染，对临床诊断不同感染状态的结核有重要意义。

本研究受到样本量小和选择范围很大的限制，这些限制可能导致掺入偏差过高估计所研究参数的诊断能力。因此，需要更大规模的前瞻性队列研究来进一步验证VCS参数。

4 结 论

淋巴细胞形态学参数通过血常规分析仪很容易获得，检测成本低，并且这些参数能快速、准确、客观地反映细胞的内在生物学特征，有潜在的临床应用价值。特别是在γ干扰素释放实验阳性结果的基础上，联合淋巴细胞VCS参数分析，为临床辅助诊断活动性肺结核提供有意义的参考。