孔径对胶原基组织工程真皮支架性能的影响

谭瑾瑜 廖冠睿 谭 妍 曹金成 罗 静 陈杏欢 祁少海 陈 蕾*

(1.中山大学 中山医学院临床医学系，广东 广州 510080；2.中山大学附属第一医院 烧伤外科，广东 广州 510080)

1 引言

真皮缺损的修复是临床治疗的难点和组织工程学研究的重点。胶原基组织工程真皮的构建多以多孔支架材料作为载体或以多孔支架材料为主体，目的是对细胞外基质的成分、结构和功能进行仿生。孔径是此类材料的重要参数之一，可以直接或间接地决定支架的孔隙率、孔隙连通性及力学性能，对细胞的粘附、渗透、迁移、生长、营养物质传送、血管长入及代谢产物交换有重要的影响。

2 孔径对组织工程支架物理性能的影响

组织工程支架的物理性能必须与生物体相匹配。现代组织工程材料的孔径大小一般可分为三个等级：纳米级(<100nm)、微米级(100nm-100μm)、泛微米级(100μm-1mm)。孔径的大小在一定程度上影响着支架的机械强度、抗拉强度等物理性能，是决定支架能否与生物体相适应的关键因素之一。研究表明泛微米级支架的交联密度与其力学性能呈正相关关系。K.F.Leong等发现孔隙大小在微米级别的支架机械强度不高，但孔间互连，使材料渗透率保持较高水平[1]——这是决定细胞能否进行代谢活动的关键。

孔径的均匀性也会对支架的机械刚度、扩散率、渗透率造成显著影响。压力作用时，支架会从薄弱处开始断裂。孔径的平均差值就成为了衡量支架稳定性的标准之一。材料的相邻孔径差越大，材料就越容易被破坏，相同的应力值下薄弱处一旦开裂，必将引起整个支架的崩塌。此外，不均匀的孔隙互联性不高，扩散率相对较低，渗透率较低，引起营养物质扩散滞后[2]。

3 孔径对组织工程支架生物学性能的影响

细胞迁移行为在生化刺激、细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互作用下发生的。研究表明：过小的孔径会导致细胞迁移的不完全，甚至在支架周缘形成包囊，影响营养物质的吸收和废物的排泄[3]；而太大的孔径会使支架的比表面积下降，影响细胞的粘附和增殖分化。一项采用大小两种孔径的支架探究孔径影响细胞增殖与分化的实验表明：小孔径支架利于细胞迁移，培养的细胞初始增殖率较高，但会限制细胞聚合体的形成，不利于细胞分化。相反，孔径较大(141mm)的支架有提高体外骨组织整合和抑制纤维组织生成的潜力，提示具此类孔径的支架培养细胞时细胞分化和聚集程度更高，[4]这可能与大孔径材料更利于营养物质和氧气的运输有关。

4 人真皮细胞外基质的孔径特点

真皮为表皮下方的致密结缔组织，血管丰富，主要组成成分为成纤维细胞及其分泌的胶原纤维。研究发现，人真皮细胞外基质靠近表皮与皮下组织的部分胶原纤维含量比中间层少：表皮-真皮结合处的胶原纤维占比约为19.26%；结合处以深至773.55μm以内，胶原纤维占比增加到39.97%左右；而在真皮-皮下交界处171.9μm范围内，胶原纤维的占比降至23.07%左右。胶原纤维占比越少，区域组织的孔隙直径就越大——提示真皮靠近表皮与皮下组织部分的孔径大于真皮中间层。Wang等人对人真皮的三维结构进行了研究，发现其细胞外基质的孔隙直径约为131.2±96.8μm，中间值是95μm，且真皮-表皮结合处孔隙直径较小[5]，该结果证实了人真皮细胞外基质的天然孔径具有不对称(三明治夹心样)的特性，提示根据皮肤自然结构设计的梯度材料支架可为深及真皮的创面愈合提供更好的促进愈合效果[2]。

5 胶原基组织工程真皮支架的孔径设计

胶原是制作支架最常见的材料。Wang等用Ⅰ型胶原蛋白为原料制作不同孔径的单层支架进行体外和体内实验，结果显示孔径为166.9μm的支架降解能力最好，成纤维细胞的粘附和增殖细胞数量最多，而87.7μm的支架细胞数量最少。体内实验发现，孔径为166.9μm和120.4μm的支架所形成的肉芽组织的厚度差异无统计学意义。综合体外和体内实验的各项指标，孔径为166.9μm的单层支架最优。而当胶原支架设计的细孔为定向垂直于伤口的通道时，孔径为100μm的支架在几种伤口愈合参数中均获得了良好的效果，但随着孔径增大细胞嫁接率减少，矩阵稳定性降低。同时，在动物模型中，孔径为80μm，100μm，120μm的支架在促进体内伤口愈合上表现无差异。体内实验中，当孔径范围在80-120μm时，支架的体内稳定性和孔径的大小成负相关[6]。

在胶原中加入其它材料制成的支架也有巨大的应用潜力。Bonvallet等人用胶原(聚ε-己内酯)和静电纺丝(PCL)制成的支架的最佳孔径为160μm[7]，体内实验证明，在此孔径下可加速伤口闭合，同时也保持了足够的拉伸强度、低收缩性和合适的降解速率等。

另一种最佳孔径范围在120-140μm之间的明胶-壳聚糖海绵支架，具有孔结构均匀，高孔隙率(>90%)，高吸水能力(>1500%)，高保水能力(>400%)的特点。生物相容性结果表明，此海绵支架适合细胞黏附和增殖并为皮肤创面愈合提供有效的支持和附着。是一个具有适当的物理性能和生物相容性的良好组织工程真皮材料。

综合来看，以胶原为主材料的组织工程真皮支架的最适孔径一般为100-200μm。孔径较大的支架能够更好的提供氧气和其他营养物质，但细胞的嫁接率会受影响，细胞的增殖和扩散率会降低。同时，海绵状支架因其孔结构的均匀性、高孔隙率、孔结构方向的无固定性可以使细胞更好的在整个支架中增殖迁移，从而在细胞生长方向的广泛性上有一定的优越性。

6 现存问题与可能的解决方式

目前的研究显示最佳孔径并不是绝对的，植入培养的细胞不同，细胞培养的阶段不同，所用材料不同甚至组织工程皮肤制备工艺的不同所得的最佳孔径可能不相同。Bruzauskaite等发现不同组织再生所需的孔径随着移植细胞和再生组织的体积和起源有所不同。平滑肌上皮，神经细胞和成纤维细胞在50-160μm的孔径中生长最好，而微血管上皮细胞要求小于38μm的孔径[8]。Murphy等研究表明细胞生长的不同阶段所需最佳孔径不同，支架培养24h和48h时，120μm孔径出现细胞培养小高峰，提示在细胞黏附阶段小孔径支架能提供更多可黏附面积因而有利于细胞黏附，但是在培养7天时，小高峰消失，提示在细胞增殖长入阶段大孔径更有优势。且孔径并非越大越好，孔径增大将导致物理性能的降低[9]。孔隙率从58%上升到80%时，抗压强度从11.0MPa下降到2.7MPa，该法制造的支架孔隙率在80%左右能更好平衡微孔连通性和物理性能。而孔径的上限根据应用的不同上限不一，有结果显示孔径从45-150级别增加到300-600级别，抗屈强度却无明显变化。综上所述，组织工程支架的最佳孔径和孔隙率没有绝对的定值，特定组织工程支架的最佳孔径有待结合其预期作用，培养的细胞等条件具体分析，“因地制宜”的最佳孔径的确能提升组织修复的效果。

想获得孔径最佳的组织工程真皮支架还需要解决制备的问题，传统的制备工艺如粒子浸出法/溶液浇注，气体发泡法，热致相分离法等无法灵活控制孔径和支架条宽，存在形成闭孔，孔隙率不高或有机溶剂使活性因子失活等缺点，静电纺丝法和快速原型制造技术或许是未来制备工艺的趋势。利用3d打印技术，可以实现更精准的控制和立体结构制造。静电纺丝法的纤维排列紧密导致支架的孔径较小，这限制了它的应用范围，而通过电场分布控制、盐析法、聚合物析出法等方法为制备大孔径纤维支架提供了可能。快速原型制造技术中的3D喷墨打印和3D挤压打印能够精确控制物理梯度和生物梯度，以更好地模仿机体的天然组织结构。两种方法均通过计算机辅助的逐层打印方式将生物墨水甚至细胞打印成支架，不同区域可以获得指定的不同的孔径和孔隙率，甚至可以由不同的生物材料以不同配比组成[11]。但目前可供选择的生物材料有限，且支架制成后评价支架中细胞反应的方法有所欠缺。

7 结语

目前，对于不同制作材料、用于不同组织的支架应具有的孔径相关属性尚无统一定论。在真皮损伤修复中，以胶原为主材料的支架的最适孔径一般为100-200μm，如能根据不同部位真皮组织的结构特点对材料孔径进行进一步精确控制的话，将有望实现对创面更为精准、高质的修复目标。