干旱诱导的甘蓝型油菜SSH文库及抗旱相关基因表达的分析

谢小玉，侯爽，冉春燕

(西南大学农学与生物科技学院，重庆 北碚 400715)

干旱是限制作物产量提高的重要非生物因子。季节性干旱是油菜生产的主要自然灾害之一，严重影响油菜的生长和产量。据报道，春旱可使中国油菜减产20%以上[1]，因此，了解油菜抗旱机制，培育抗旱品种非常重要。

研究表明，抗旱性是多基因控制的性状。ZHONG等[2]研究表明，油菜BnNAC2和BnNAC5参与植物对盐、干旱和ABA的胁迫应答。万乔[3]从甘蓝型油菜中克隆到干旱胁迫相关基因BnBip，且研究表明该基因的表达受干旱胁迫诱导，超量表达可提高植物对干旱胁迫的耐受力。

抑制消减杂交(SSH)常被用于差异表达基因的分离和cDNA文库的构建。在抗病基因的筛选和研究上，前人利用SSH技术构建了环形泰勒虫[4]、普通野生稻[5]、黄瓜[6]、青稞[7]等作物的抑制消减文库，筛选出与抗病相关的基因；在非生物胁迫方面，利用SSH技术，筛选出了与山葡萄抗寒性相关的抗冻蛋白(AFPs)、热休克蛋白(Hsps)、防御素样蛋白、细胞色素P450加单氧酶等多个相关的ESTs[8]；在抗旱基因的研究上，前人利用SSH技术构建了獐茅[9]、柠条[10]、大豆[11]、棉花[12]、蚕豆[13]等作物的抑制消减文库，筛选出与抗旱相关的基因。

本研究以抗旱甘蓝型油菜Holiday为材料，通过对SSH技术构建的油菜干旱诱导的cDNA文库的测定分析，筛选在干旱胁迫下油菜的差异表达基因及参与抗旱的代谢途径，从该文库中随机筛选抗旱相关基因进行实时荧光定量PCR表达分析，旨在为揭示油菜抗旱的分子机制和克隆油菜抗旱基因提供依据。

1 材料与方法

1.1 SSH文库分析

从前期成功构建的SSH文库[14]中，以巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R进行菌液PCR 扩增, 对阳性克隆进行进一步筛选，挑选有清晰单一条带的646个片段，较长的阳性克隆对应菌液送宝生物工程(大连)有限公司测序；应用VecScreen去除构建文库时所用的载体及巢式引物接头序列，摒弃低质量的序列；利用 Blast 程序在 GenBank 中寻找同源序列，分析基因功能；采用 KOBAS 程序进行基因功能归类和代谢途径分析，寻找与抗旱密切相关的代谢途径；运用 Blast2GO对功能蛋白进行注释和分类。

1.2 抗旱相关基因的表达分析

以抗旱性强的甘蓝型油菜Holiday为材料，种子用15%次氯酸钠消毒20 min，用无菌水清洗4～6次后播种于口径为30 cm花盆中，每盆装沙壤土12 kg，出苗后每盆留苗3株，常规管理。开花初期(整个植株4%～5%的花开放)，对油菜进行干旱处理，在处理的第1、3、5、7天(土壤含水量分别为60%、40%、30%、20%)剪取对照(未经干旱处理)和各干旱处理顶部完全展开的第2叶，液氮速冻，–80 ℃保存。采用 First Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)合成 cDNA，按照试剂盒说明书，测定其纯度和浓度。随机选取文库中筛选到的3个与干旱胁迫相关的P5CSb、BnSOS2和CAM基因，通过引物设计和内参基因筛选[15–16]，进行实时荧光定量PCR分析。

1.3 数据处理

参照PFAFFL[17]的方法计算目的基因相对表达量；采用 Microsoft Excel 2007和SAS统计软件分析数据和作图。

2 结果与分析

2.1 SSH文库检测结果

对成功构建的SSH文库随机挑选850个单菌落进行阳性克隆筛选，726个含有插入片段，其中48个单菌落电泳结果如图1所示。13、26、8、20、29号是空质粒或非特异性克隆，阳性克隆率约为89.6%，克隆片段长250～1 000 bp，平均长度545 bp。

2.2 测序结果分析

通过对646个经PCR鉴定的阳性克隆测序，获得 639个单一的表达序列标签数量(expressed sequence tag，EST)，经过聚类、拼接和去除冗余，获得重叠群(contigs)89条，单拷贝序列 (singleton)97条。序列长度介于101～800 bp，其中EST长度101～300 bp的有11条，301～400 bp的有28条，401～500 bp的有37条，501～600 bp的有34条，601～800 bp的有76条。平均长度为531 bp。

图1 SSH文库阳性克隆片段检测结果Fig.1 Positive fragments analysis of SSH cDNA library

2.2.1 EST序列分析

对测序获得的186条单一序列进行Blastn和Blastx数据库的序列比对，发现其中166条具有同源基因，其主要来源于拟南芥、甘蓝型油菜、白菜、黄瓜、大豆、蒺藜苜蓿、草莓等物种；其余20条没有匹配项。具有同源基因的EST中，154条与已知功能的蛋白有同源性，6条与假想蛋白有同源性，4条与推定蛋白有同源性，2条与未命名蛋白有同源性(表1)。其中MYB、NAC5、锌指蛋白等转录因子以及苹果酸脱氢酶、核酮糖1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶、果糖–1,6–二磷酸醛缩酶、磷酸核酮糖激酶等与光合相关基因以及P5CS基因、F–box 蛋白等参与油菜干旱胁迫应答。表1列出了部分ESTs及其功能。

表1 油菜叶片干旱胁迫下部分诱导表达的基因Table 1 Part result of blast alignment in rapeseed leaves under drought stress

表1(续)

表1(续)

2.2.2 KEGG代谢途径分析和基因功能分类

以拟南芥为参考物种，利用 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书)的序列注释分析系统(KOBAS)程序进行代谢途径分析。结果表明，186条单一序列中160条序列得到匹配， 26条序列无匹配信号。57条EST定位到70条代谢途径中，表明这70条途径与植物的抗旱性有关。P＜0.5的48条代谢途径中，乙醛酸和二羧酸代谢、碳代谢、光合碳固定、泛素–蛋白酶体途径、氨基酸合成代谢、氮代谢、氰基氨基酸代谢、糖酵解、柠檬酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢、植物激素信号转导及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等12个途径都有3条及3条以上EST定位其中。P＜0.1的代谢途径如表2所示。

表2 KOBAS分析的干旱诱导代谢途径Table 2 Representative drought-induced metabolic pathway identified by KOBAS

根据P值推测乙醛酸和二羧酸代谢、碳代谢、光合器官中的碳固定、泛素–蛋白酶体途径、氨基酸生物合成、氮代谢可能在油菜干旱胁迫应答中发挥着重要的作用。

2.2.3 GO基因注释和功能分类

通过对186条单一序列进行GO功能注释、分类，结果表明，111条EST共同在细胞组分、分子功能、生物学过程中执行着功能，141条EST在生物学过程中发挥作用，133条EST在分子功能中发挥作用，144条EST在细胞组分中发挥作用。而细胞组分、分子功能及生物学过程的注释中分布的亚类各不相同(表3)，这些单一序列涉及到细胞组分中所占比例较大的是细胞(cell)和细胞器(organelle)，分子功能中所占比例较大的是蛋白绑定(Binding)和催化活性(catalytic activity)，生物学过程中所占比例较大的是细胞过程(cellular process)和代谢过程(metabolic process)，表明甘蓝型油菜在干旱胁迫下细胞及细胞器有关的组分和元件响应积极，绑定结合和催化活性功能加强，新陈代谢加速，防御机制加强。

表3 GO基因注释的功能分类的主要亚类及其比例Table 3 Main sub-category and percentage of GO annotated gene classification of EST

2.3 3个抗旱基因表达分析

2.3.1 总RNA质量检测及内参基因的引物筛选

对样品的总 RNA及 mRNA质量检测结果显示，抽取的 RNA品质和纯度符合反转录和RT–qPCR的要求。通过对ACT7和UBC21候选内参基因的稳定性分析，选择ACT7作为 RT–qPCR分析中的内参基因[15]。其中目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR引物如表4。

表4 目的基因和候选内参基因的RT–qPCR引物Table 4 The primers of candidate reference genes and target gene

2.3.2 3个抗旱基因表达量分析

对3个抗旱基因的相对表达量(表5)进行分析。结果表明：在干旱胁迫 1～5 d，油菜叶片中CAM和BnSOS2基因表达量均升高，而P5CSb在干旱胁迫后先轻微下降，第 5 天开始其表达量超过处理前。在干旱胁迫的前期(第1～5 天)，基因表达量从大到小依次为CAM、BnSOS2、P5CSb，干旱胁迫的后期(第 7 天)，基因表达量从大到小依次为CAM、P5CSb、BnSOS2；在整个干旱胁迫期间，BnSOS2和CAM基因表达量先增加后降低。总体而言，CAM、BnSOS2和P5CSb基因在干旱胁迫后均出现了上调表达，推测这些基因在油菜抵抗干旱胁迫中发挥了重要作用。

表5 干旱胁迫下3个抗旱基因的表达量Table 5 Expression values of three drought-related genes in leaf under drought stress

3 结论与讨论

当植物受到干旱胁迫时，植物能在分子水平上作出适应性调节，从而增强其对胁迫的耐受性。本研究结果表明，乙醛酸和二羧酸代谢、碳代谢、光合器官中的碳固定、泛素–蛋白酶体途径、氨基酸生物合成、氮代谢等可能在油菜干旱胁迫应答中发挥着重要作用。SINGH等[18]的研究结果表明，转基因植物中AtNAC19、AtNAC55和RD26等过量表达均能提高转基因拟南芥的抗旱能力；锌指蛋白在转录调节、病原菌防御及胁迫反应等关键过程中发挥重要作用[19]。本研究中，MYB(contig35)、NAC(contig39)、锌指蛋白(contig37)等转录因子及泛素类蛋白基因、抗脱水素基因、渗透调节相关基因(甘氨酸蛋白等)、抗氧化胁迫基因及光合作用相关基因参与油菜干旱胁迫应答，与前人的研究结果一致。

干旱对光合碳同化过程中重要酶类的活性产生影响。研究表明，在轻度和中度干旱胁迫下，核酮糖–1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的活性以及1,5–二磷酸核酮糖(RuBP)的含量和活性基本保持稳定；在严重干旱时，二者降低；不抗旱的植物种类或品种降低幅度更大[20]。葡萄在干旱胁迫下，磷酸核酮糖激酶等会发挥关键性的作用，以抵御干旱胁迫[21]。与光合碳同化过程有关的其他一些酶，如蔗糖磷酸合成酶(SPS)、果糖–1,6–二磷酸脂酶、NADP–苹果酸酶(NADP–ME)和 NADP–苹果酸脱氢酶(NADP–MDH)、碳酸酐酶(CA)以及 5–磷酸核酮糖激酶等的活性在干旱胁迫下都受到不同程度的抑制[22]。本研究结果表明，干旱胁迫下与油菜光合相关的苹果酸脱氢酶 (contig16、CTE9)、核酮糖1,5 – 二磷酸羧化酶/加氧酶(contig89)、果糖–1，6–二磷酸醛缩酶(contig1、contig4)、磷酸核酮糖激酶(contig86、contig27)等参与光合碳固定过程，为油菜抵御干旱储备能量。

P5CS基因作为谷氨酸途径的限速酶，对谷氨酸含量的积累特别关键；周精华等[23]的研究结果表明，P5CS基因受干旱胁迫的诱导。BnSOS2基因编码丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，作为抗盐相关基因研究得较多[24]，而作为干旱胁迫基因研究得较少。本研究中发现，BnSOS2基因在受到干旱胁迫时表达量增加，说明BnSOS2参与了干旱胁迫的信号转导。CAM(钙调蛋白)是Ca2+的受体，与Ca2+结合后，具有了催化活性的CAM基因[25]，可以激活许多下游靶细胞，调节靶蛋白的活性，响应干旱胁迫。本研究中，P5CS、BnSOS2、CAM基因在干旱胁迫下均呈现不同程度的上调，表明这3个基因均参与了干旱胁迫的应答。