猪血浆球蛋白的高效制备研究

杨海，张淇美，龚慧芳，唐青海，阳希，岳跃飞

（1.衡阳师范学院 南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421008；2.南岳生物制药有限公司 湖南省血液制品工程技术研究中心，湖南 衡阳 421007）

我国是养猪大国，随着养猪业的规模化发展和猪肉消费的持续增加，猪血逐渐成为生猪集中屠宰加工过程中的重要副产物[1]。据估计，2019 年我国猪血产量约200 万吨，由于深加工技术制约，大部分猪血用来直接食用或制作动物饲料等低附加值产品[2]，因此，猪血深加工技术越来越受到重视[3]。

球蛋白是一类具有抗体活性或结构与抗体相似的球蛋白，是机体免疫作用和抗病能力中最关键、最直接的基础性物质，在人和动物疾病防治中发挥了重要作用。据报道，猪免疫球蛋白能有效治疗轮状病毒引起的婴幼儿腹泻[4]、家禽呼吸道疾病[5]，仔猪口服猪免疫球蛋白能显著提高存活率[6]，在科研工作中则常常用来标记抗原[7]。随着人们对猪球蛋白功能的认识不断深化，猪球蛋白在生物医药中的应用逐渐铺开，市场对猪球蛋白量与质的需求越来越高，迫切需要对猪球蛋白的高效制备技术进行研究。

从母猪初乳中可以提取到高质量的猪球蛋白，但存在提取成本高、条件要求高、原料来源少等不足，难以规模化生产。猪血中的球蛋白含量高达2 %，而且产量丰富，成本低廉，因此，从猪血中提取球蛋白是实现猪球蛋白规模化生产的可靠途径[8]。目前，从猪血中提取球蛋白的方法有盐析法、辛酸沉淀法、层析法、免疫吸附法、利凡诺法等，存在回收率低、纯度低、成本高以及环境污染等不足[8-9]。

本研究旨在以新鲜猪血为原料，采用差速离心法获得猪血浆，探索并确定猪血浆球蛋白制备过程中的血浆稀释倍数、pH、乙醇浓度和温度四个关键参数，通过三次乙醇反应和纯化操作，从猪浆血中分离提取球蛋白，为猪血浆球蛋白的规模化制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

柠檬酸三钠、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾、乙醇、氯化钠、柠檬酸、醋酸、醋酸钠、氢氧化钠、盐酸均购自天津科密欧试剂公司，标准酪蛋白购自Sigma 公司，猪球蛋白标准品购自北京博尔西公司，蛋白Marker 购自赛默飞公司。

1.2 主要仪器

pH 计（优特仪器有限公司，ECPH70042S）、低温离心机（Eppendorf， 5920 R）、探针式温度计（欧达时，TP500）、低温恒温槽(江苏恒诺仪器有限公司，NDC-3020J）、全自动蛋白电泳分析仪（美国海伦娜公司，SPIFE4000）、可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司，UV2150）、磁力搅拌器、电热恒温水浴锅等。

1.3 试验方法

1.3.1 差速离心获取血浆

新鲜猪血和3.8 %的柠檬酸三钠按照9：1 比例混匀，4 ℃静置30 min 后，4 ℃1000 r/min 离心30 min；取上清液，4 ℃3000 r/min 离心30 min，取上清液，得到清亮血浆。血浆分装，于－20 ℃条件下保存。

1.3.2 蛋白浓度测定

采用双缩脲法测定蛋白含量，具体操作为：将蛋白溶液与试剂按表1 混合，37 ℃水浴20 min，冷却至室温后，在紫外分光光度计（540 nm）上进行检测并获得数据。

表1 猪血浆蛋白浓度配比

1.3.3 猪血浆球蛋白的制备

根据拟定的猪血浆球蛋白制备技术路线（图1），将乙醇反应分为三个阶段，在低温恒温槽内完成三次乙醇反应：

图1 猪血浆球蛋白制备技术路线

第一次乙醇反应：用0.9 %的氯化钠稀释血浆至蛋白含量为5 %，1 mol/L 的柠檬酸调pH 至6.8-7.1，降温至1.5 ℃-0.5 ℃；边搅拌边缓慢加入-15 ℃、95 %的乙醇，控制最终乙醇浓度为20 %（按每1000 毫升血浆制品加267 毫升95 %乙醇计算）；复测pH 并调制6.9-7.1，于-4.5 ℃至-5.0 ℃搅拌（反应），-3.0 ℃至-5.0 ℃温度下离心30 min，取沉淀。

第二次乙醇反应：沉淀用-2 ℃-0 ℃、0.01 mol/L的氯化钠溶解，定容至12-14 倍沉淀体积；沉淀充分溶解后，用pH4.0 的醋酸-醋酸钠缓冲液调pH 至5.4-5.6，降温至-0.5 ℃--1 ℃；边搅拌边缓慢加入－20 ℃、95 %的乙醇，控制乙醇终浓度为14.5 %-15 %；复测pH 并调至5.4-5.5，-4.8 ℃至-5.3 ℃条件下搅拌（反应）；-3.0 ℃至-5.0 ℃条件下离心30 min，取上清。

第三次乙醇反应：每1 L 上清加入5 g 氯化钠，控制乙醇浓度为18 %-20 %；用0.5 mol/L 的氢氧化钠调pH 至6.9-7.1；-5 ℃至-6 ℃条件下搅拌（反应），-4.0 ℃至-6.0 ℃条件下离心30 min，沉淀即为球蛋白粗品。

蛋白纯化：5 倍球蛋白粗品沉淀量、2-4 ℃的去离子水溶解沉淀；1 M/L 的醋酸调pH 至4.0 左右，澄清后过滤，收集沉淀；中空纤维超滤柱超滤脱醇；0.5 M/L 的盐酸调pH 至3.6-3.7；调蛋白浓度至6-8 %，用7-8 ℃的去离子水连续6 次等体积透析，收集沉淀并冻干，于-20 ℃条件下保存。

1.3.4 猪血浆球蛋白的定性定量分析

采用SDS-PAGE 法进行定性分析，即采用5 %浓缩胶、12 %分离胶，获得SDS-PAGE 电泳图，并于标准蛋白进行比对。

取0.1 g 冻干后的粗蛋白沉淀，充分溶于100 mL 的纯净水中，利用全自动蛋白电泳分析仪完成蛋白定量检测，直接获取蛋白纯度和含量数据，并采用SPSS11.0 软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 目标蛋白的定性分析

SDS-PAGE 电泳图谱分析可知，如图2 所示，提取产物在56KD 和27kD 处出现标志性条带，与猪血浆球蛋白标准品条带大小一致，说明获得物为猪血浆球蛋白。

图2 球蛋白SDS-PAGE 电泳图谱

2.2 目标蛋白的定量分析

全自动蛋白电泳分析仪获得扫描图像（图3），结果显示，猪血浆蛋白峰单一且集中，说明提取的蛋白具有较高的纯度。

图3 球蛋白电泳分析图谱

2.3 第二阶段稀释倍数对球蛋白制备的影响

第二阶段不同稀释倍数对球蛋白提取的影响见表2。由表2 可知，当蛋白沉淀稀释12 倍时，球蛋白得率可以达到25.6 g，纯度可以达到99.3 %，明显高于稀释倍数为17和22时的球蛋白得率和纯度。

表2 第二阶段不同稀释倍数对球蛋白提取的影响

2.4 pH 对球蛋白制备的影响

乙醇反应时，pH 对球蛋白提取的影响见表3、表4 和表5。

表3 第一阶段乙醇反应pH 对球蛋白提取的影响

由表3 可知，第一阶段乙醇反应，当pH 为7.0时，球蛋白得率和纯度最高，分别达到29.1 g 和97.2 %，显著高于pH 为6.0 和6.5 时的球蛋白得率和纯度，说明第一次乙醇反应的适宜pH 为7.0。

表4 第二阶段乙醇反应pH 对球蛋白提取的影响

由表4 可知，第二阶段乙醇反应，当pH 分别为4.5、5.0 和5.5 时，球蛋白得率没有显著差异，均超过24 g，但pH 为5.5 时的球蛋白纯度显著高于pH 为4.5 和5.0 时的球蛋白纯度。

表5 第三阶段乙醇反应pH 对球蛋白提取的影响

由表5 可知，第三阶段乙醇反应，当pH 为6.5和7.0 时，球蛋白得率没有显著差异，但均高于pH为6.0 时的球蛋白得率；pH 分别为6.0、6.5 和7.0时，球蛋白纯度却无显著差异。

2.5 乙醇浓度对球蛋白制备的影响

第二阶段乙醇浓度对球蛋白制备的影响见表6。

表6 第二阶段乙醇浓度对球蛋白提取的影响

由表6 可知，第二阶段乙醇浓度为15 %时，可以获得较好的球蛋白得率和纯度，乙醇浓度为10 %和20 %时，球蛋白得率和纯度差异并不显著，但低于15 %的乙醇浓度时，蛋白得率和纯度则会显著降低。

表7 第三阶段乙醇浓度对球蛋白提取的影响

由表7 可知，第三阶段乙醇浓度为18 %时，可以获得较好的球蛋白得率和纯度，高于18 %的乙醇浓度时，球蛋白得率和纯度差异不显著，但低于18 %的乙醇浓度时，球蛋白得率和纯度则会显著降低。

3 结论与讨论

球蛋白是决定机体抗病能力的关键物质，也是具有广阔市场前景的生物药物[10]。球蛋白可以从初乳、蛋黄等生物材料中提取，但存在成本高、条件要求高等不足。随着我国养猪业的规模化发展和生猪集中屠宰的推进，猪血深加工逐渐成为一个行业热点问题。免疫球蛋白占猪血浆蛋白总量的16.3 %，从猪血浆中提取球蛋白成为首选[11]。因猪血的成分复杂，脂蛋白含量高，提取其球蛋白方法不同程度地存在纯度低、回收率低、分离效率低、成本高以及介质残留等尚待解决的问题，因此建立一套成熟的猪血浆球蛋白制备工艺，对于延长猪血产品附加值、减少屠宰环节污染、促进生物产业发展均具有重要意义。

低温乙醇沉淀法是人血浆球蛋白制备的主要方法，其基本原理是：低温状态下，血浆中加入乙醇，借助乙醇较低的介电系数，夺取与溶质结合的水分子，使蛋白质分子间的吸引力增大，溶解度降低，继而生成沉淀。低温乙醇沉淀法用于制备猪血浆球蛋白，必须解决此方法的适用性问题，特别是需要探明影响猪血浆球蛋白得率和纯度的关键参数。

蛋白浓度对低温乙醇法提取蛋白具有重要影响[12]。蛋白浓度过高会引起目标蛋白变性（形成聚合体）或者纯度降低，蛋白浓度过低则会降低目标蛋白的回收率。因此，要使球蛋白充分溶解，提高得率，第二次乙醇反应时的沉淀物稀释倍数非常重要。本研究的结果表明，第二次乙醇反应时，沉淀12 倍稀释，球蛋白得率和纯度分别为25.6 %和99 %，显著高于沉淀17 倍和22 倍稀释时的球蛋白得率和纯度（p＜0.05），说明沉淀稀释倍数在12 倍时，比较适合猪血浆球蛋白分离。

蛋白质是带电的两性电解质，当蛋白质溶液处于等电点pH 时，蛋白间的静电荷为零，相邻的蛋白质由于没有静电斥力而集聚沉淀。猪血浆球蛋白的等电点pH 在5.8-7.3 之间，因此，获得三次乙醇反应的适宜pH 是进行高效制备球蛋白的前提和基础。第一次乙醇反应的主要目的是沉淀血浆球蛋白，因此pH 要靠近球蛋白的等电点，并远离杂蛋白的等电点，使球蛋白形成沉淀，杂蛋白则留在上清液中。研究结果表明，pH 在7.0 时，球蛋白得率和纯度分别为29.1 %和97 %，显著高于pH为6.0 和6.5 时的蛋白得率和纯度（p＜0.05），说明pH7.0 比较适合猪血浆球蛋白分离。第二次乙醇反应的主要目的在于去除沉淀杂蛋白，pH 在5.5 时，球蛋白得率和纯度分别为26.7 %和99 %，显著高于pH 4.5 和5.0 时的得率和纯度（p＜0.05），说明pH 在5.5 时适合猪血浆球蛋白分离。第三次乙醇反应主要目的在于沉淀球蛋白。研究结果表明，pH在7.0 时，球蛋白得率和纯度分别为33.0 %和98.7 %，显著高于pH 6.0 和6.5 时的得率和纯度，说明pH 在7.0 时适合猪血浆球蛋白分离。

乙醇可以降低蛋白的介电系数，使其溶解度急剧下降，随着乙醇浓度的提高，球蛋白溶解度逐渐下降，调整乙醇浓度是沉淀球蛋白的手段之一。第二次乙醇反应，乙醇浓度在15 %时，球蛋白得率和纯度分别为30.8 %和98.4 %，显著高于乙醇浓度在10 %和乙醇浓度在20 %时的得率和纯度（p＜0.05），说明乙醇浓度在15 %时，比较适合猪血浆球蛋白分离；第三次乙醇反应，乙醇浓度在18 %时，球蛋白得率和纯度分别为28.7 %和98.5 %，显著高于乙醇浓度在11 %和乙醇浓度在25 %时的得率和纯度（p＜0.05），说明乙醇浓度在18 %时适合猪血浆球蛋白分离。

温度是维持蛋白结构功能的主要因素[13]，球蛋白是一种活性蛋白，制备过程中的温度控制非常关键。本研究采用高精度探针式温度计对乙醇和蛋白工作液进行温度检测，在低温恒温槽（温度波动范围±0.05 ℃）内完成三次乙醇反应，有效保障了球蛋白制备过程的温度要求。研究表明，全程操作温度控制在-4 ℃至-5 ℃的情况下，猪血浆球蛋白具有较高的回收率和纯度，也具有较清晰的电泳图谱。

目前，已有低温乙醇法提取牦牛血清球蛋白[14]和抗人T 细胞猪免疫球蛋白[15]的报道，尚无低温乙醇法制备非特异性猪血浆球蛋白的报道，本文对低温乙醇法制备猪血浆球蛋白进行了适用性研究，确定了工艺步骤和关键参数，获得了较高的球蛋白回收率和纯度，为猪血浆球蛋白的规模化制备提供了参考。