新疆南疆部分规模牛场犊牛轮状病毒、冠状病毒感染情况调查与基因鉴定

崔 鑫 ， 孟凡艳 ， 鱼海玮 ， 张迎春 ， 黄 腾 ， 胡建军

(1. 塔里木大学动物科学学院 ， 新疆 阿拉尔 843300 ； 2. 新疆生产建设兵团第一师畜牧兽医工作站 ， 新疆 阿拉尔 843300)

腹泻是引起1月龄以内犊牛死亡的主要原因，犊牛腹泻病因极其复杂，通常引起新生犊牛腹泻的原因包括非感染性因素(如饲养环境因素、营养因素)和感染性因素(细菌、病毒和寄生虫等因素)。牛轮状病毒(Bovine rotaviru,BRV)和牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起1月龄左右的犊牛发生严重脱水性腹泻的非细菌性主要病原体[1]。这2种病毒均通过粪口途径传播[2]，并能适宜低温的生长环境，寒冷的季节可导致病毒的积累，临床上多以急性发作的水样腹泻为主要特征，病情较重时出现大量血液粪便、脱水和虚弱，甚至死亡，严重阻碍犊牛的生长发育[3]。BCoV引起的疾病临床过程、组织学的损伤、腹泻产生的机理及发病犊牛的年龄都与BRV相似，且感染毒力和造成的死亡率均高于BRV[4-5]。这2种病毒常常会发生混合感染，造成病牛的临床症状更加严重，当继发细菌感染时，会出现发病急、死亡迅速的特点[6-7]。

养牛业是新疆南疆地区的重要畜牧产业之一，犊牛感染BRV、BCoV会对养牛业造成极大的经济损失。为调查新疆南疆地区部分规模化奶牛场中是否存在这2种病毒的感染，本试验从规模化奶牛场中采集腹泻发病犊牛的粪便样品，采用ELISA和逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法进行检测、分析，为当地规模化奶牛场这2种病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2017年10月—2018年2月，在新疆南疆地区12个规模化奶牛场共采集1月龄以内发生腹泻症状的犊牛粪便样品325份，冻存于-20 ℃ 冰箱中备用。

1.1.2 主要试剂 BRV、BCoV抗原双抗体夹心ELISA试剂盒，购自美国爱德士(IDEXX)生物科技公司；病毒检测用RNA提取试剂盒、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit等，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 每份粪便样品取0.5 g于1.5 mL灭菌离心管中，加入1 mL生理盐水旋涡振荡，8 000 r/min 离心2 min，取上清液100 μL于新的灭菌离心管中，保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2 BRV和BCoV抗原的ELISA检测 通过商品化BRV和BCoV抗原双抗体夹心ELISA试剂盒，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 BRV与BCoV的RT-PCR检测 经BRV和BCoV抗原双抗体夹心ELISA试剂盒检测为阳性的粪便样本作为RNA提取样本，按照病毒检测用RNA提取试剂盒说明书进行RNA的提取，提取后的RNA于-80 ℃冰箱保存备用。

BRV、BCoV的PCR扩增引物[8](表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 BRV与BCoV的RT-PCR扩增引物

BRV的RT-PCR检测反应体系(25 μL)：PrimeScrip 1 step Enzyme Mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，模板RNA 2.5 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，RNase Free ddH2O 8.5 μL，混匀后瞬时离心。PCR反应条件：50 ℃反转录30 min；95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。取3.0 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。

BCoV的RT-PCR检测反应体系(25 μL)：PrimeScrip 1 step Enzyme Mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，模板RNA 2.5 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，RNase Free ddH2O 8.5 μL，混匀后瞬时离心。PCR反应条件：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性5 min；95 ℃变性50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取3.0 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。

1.2.4 PCR产物回收及测序 按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，送至北京金诺锐杰基因科技有限公司进行测序。

2 结果

2.1 BRV和BCoV抗原的ELISA检测 经BRV、BCoV抗原双抗体夹心ELISA试剂盒对所采集的粪便样品进行检测，其中12个规模化奶牛场中BRV的检出率为15.38%，BCoV的检出率为9.54%(见表2)，2种病毒混合感染率为6.67%。

2.2 BRV的RT-PCR检测 以样品的RNA提取产物为模板，BRV引物VP7-1/VP7-2进行RT-PCR，扩增出1 062 bp大小的基因目的片段；再以PCR产物为模板进行基因分型鉴定，以引物VP7-1/G5-2、VP7-1/G6-2、VP7-1/G8-2、VP7-1/G9-2、VP7-1/G10-2进行半套式RT-PCR，其中仅有引物VP7-1/G10-2扩增出715 bp大小的基因目的片段(见图1)。

2.3 BRVVP7基因核苷酸同源性分析 样本序列与NCBI下载的15个参考株序列通过DNASTAR进行核苷酸同源性比较(见图2)。结果显示，样本核苷酸序列与15个参考毒株的同源性高达90%以上，与参考株RVA(突尼斯/2014，牛，KX599304.1)和MAR(摩洛哥/2011，牛，KT726335.1)的核苷酸同源性分别为95.1%和95.6%。确定该样本为牛轮状病毒A群，命名为BRV-10T。

2.4 BRV-10T 基因分型分析 通过MEGA软件对BRV-10T基因与参考株进行核苷酸同源性比较(见图3)。结果显示，BRV-10T与15个参考毒株的同源性高达75%以上，与参考株15T(伊朗/2011，牛，KM243016.1)、BoRota(加拿大/2009，牛，JX470517.1)、BOV(摩洛哥/2014，牛，KU729666.1)、BRV-2(埃及/2015，牛，KX268317.1)、Cow-tc(美国/1983，牛，LC133552.1)、DQ-75(中国/2008，牛，GU144587.1)、HM26(中国/2008，牛，FJ545658.1)、KC-1xUK(美国/2003，牛，HQ844013.1)、MAR(摩洛哥/2011，牛，KT726335.1)、MX001(墨西哥/2006，牛，FJ217204.1)、XJX-07(中国/2007，牛，EU828784.1)、ZAF(南非/2009，牛，KP752915.1)的同源性高达80%以上，同参考株RVA(突尼斯/2014，牛，KX599304.1)的同源性最为相近，达到94.7%，经基因分型确定BRV-10T为BRV G10型。

表2 ELISA检测结果

图1 BRV的RT-PCR鉴定

2.5 BCoV的RT-PCR检测 将ELISA检测到的阳性粪便样品通过RNA的提取后，采用BCoV 的引物BCV-P1/BCV-P2，经RT-PCR扩增得到730 bp大小的目的基因片段(见图4)。

2.6 BCoV的基因核苷酸同源性分析 应用DNASTAR软件，将下载的7个冠状病毒科参考株N基因与检测的样本核苷酸序列进行核苷酸同源性比较(见图5)。结果显示，该样本与BCoV参考毒株的N基因核苷酸同源性为96.2%～98.5%，确定该样本为牛冠状病毒，命名为BCV-Aks-01株。

3 讨论

自20世纪80年代，我国首次发现BRV和BCoV后，在我国各个地区对2种病毒的报道也越来越多。李鑫等[9]对我国12个不同地区的牛血清进行了ELISA抗体检测，调查表明，BRV在我国牛群中的感染极为普遍；姜向阳[10]、田风林等[11]分别对陕西省、固原市的部分牛场犊牛进行了BRV抗原检测。沙金明等[12]、胡传伟等[13]研究表明，我国青海省及东三省都存在BCoV感染的情况；蒋静等[14]、刘合义等[15]对沿海地区的牛场进行了BCoV的抗体检测，发现BCoV感染率逐年增加，且腹泻牛群的阳性率明显高于未腹泻牛群，表明BRV与BCoV在我国牛群中的感染趋势已逐渐蔓延。

在新疆，段新华等[16]采用ELISA的方法对新疆不同地区的7个规模化牛场进行了BRV抗原检测，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的方法对其进行了复检，结果表明：各场阳性率为25%～50%，且PAGE的复检符合率为85.7%；俞银江等[17]运用犊牛腹泻四联检测试剂盒对新疆塔城地区2个团场西门塔尔发病犊牛的肠内容物进行BCoV病原检测，结果显示，阳性率为55.56%，且存在与其他致腹泻病原的混合感染。

图2 BRV VP 7基因核苷酸同源性比较(Clustal W)

图3 BRV-10T基因核苷酸同源性比较(Clustal W)

图4 BCoV的RT-PCR检测

张莹钰等[18]、张婉琪等[19]对新疆南疆BCoV进行了病毒分离、基因型鉴定及全基因组序列测定，本调查在其试验基础上采用轮状病毒和冠状病毒抗原双抗体夹心ELISA的方法对南疆地区12个规模化牛场进行了BRV、BCoV感染情况的调查，结果表明：ELISA检测到50个BRV阳性粪便样品，31个BCoV阳性粪便样品，感染率分别为15.38%和9.54%，2种病毒的混合感染率为6.76%；说明南疆部分牛场存在BRV、BCoV的感染且存在混合感染的情况，且轮状病毒是A群G10型。

图5 BCV-Aks-01株N基因核苷酸同源性比较(Clustal W)

轮状病毒根据其抗原性可分为7个群，其中A群对犊牛的感染力最强，通过轮状病毒VP4和VP7序列分析和比对，将血清群分为P基因型和G基因型。目前，全球流行的主要牛轮状病毒为G6、G8和G10型，而我国流行的主要牛轮状病毒为G6和G10型[20]，常继涛等[21]从新疆地区奶牛场的腹泻粪便样品中检测到轮状病毒G10型和G6型；而本试验发现，在新疆南疆规模化奶牛场中存在A群G10型轮状病毒感染，与国内流行的牛轮状病毒基因型是一致的。通过本调查证实，在新疆南疆部分规模化奶牛场存在BRV、BCoV感染以及混合感染的情况，为其制定完善的防控措施提供了科学依据。