5种布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试剂盒的比较

虞一聪 ， 桂平雄 ， 倪柏锋 ， 王雅婷 ， 董建斐 ， 周 蕾 ， 柴 娟 ， 谢荣辉 ， 赵灵燕 ， 徐 辉

(浙江省动物疫病预防控制中心 ， 浙江 杭州 311199)

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌属细菌引起牛、羊、猪、鹿、犬等哺乳动物和人类均可感染的一种人兽共患传染病[1]。家畜感染后母畜常发生流产、早产、死胎等，公畜引起睾丸炎和附睾炎，导致繁殖能力和生产能力下降，并影响畜产品的质量和安全[2]。世界上170多个国家和地区先后发生人兽布病疫情[3]。20世纪50年代布病曾在我国广泛流行，疫情严重地区人畜感染率达50%。20世纪80—90年代，由于防控力度加大，疫情降至历史最低水平。自2000年以后，人兽共患布病疫情呈现逐年上升趋势，对畜牧业构成了严重威胁[4]。动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T 18646)在更新至2018年版后，增加竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)作为血清学确诊试验。因试管凝集试验(SAT)操作繁琐、耗时，cELISA较SAT具有更高的特异性，且操作简便、结果判定客观。为此，作者以SAT作为参照方法，选择5个厂家cELISA试剂盒进行比对试验，根据检测结果分析评价各试剂盒的检测性能，为本实验室选择诊断用试剂盒提供参考。

1 材料与方法

1.1 血清 试验血清选取背景清楚的血清共166份，其中牛血清111份，羊血清43份，猪血清12份，均于浙江省动物疫病预防控制中心实验室-20 ℃保存。

1.2 试剂盒 5种布鲁氏菌病抗体cELISA试剂盒，分别为A试剂盒(批号：18121701)、B试剂盒(批号：181120)、C试剂盒(批号：020161903)、D试剂盒(批号：20190619)、E试剂盒(批号：110718)，分别购自国内外5家公司。试管凝集试验阴、阳性血清和抗原，均购自青岛立见诊断技术发展中心。

1.3 主要仪器 酶标仪(Tecan Infinite F50)，洗板机(Tecan Hydro Speed)，恒温箱(BINDER KB115)，离心机(Eppendorf 5424)，移液枪(Eppendorf)，微量振荡器(海门其林贝尔MH-2)，生物安全柜(Thermo 1300 SERIES A2)，高压灭菌器(TOMY SX-700)。

1.4 检测方法

1.4.1 SAT 按动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T 18646-2018)进行操作及结果判定。

1.4.2 cELISA 严格按照各试剂盒说明书进行操作并按要求判定结果，平行检测所有血清样品，且各试剂盒均在有效期内并试验成立。

1.5 数据统计与分析 采用四格表法分别对各试剂盒检测结果与SAT进行两两比较分析(表1)[5]，并利用SPSS 25.0、MedCalc 19.0等软件将检测结果进行统计与分析，采用χ2检验(McNemar法)对检测样品进行显著性差异分析，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著，采用Kappa一致性检验对准确性进行分析。

表1 评价诊断试验的四格表

1.6 成本-效果分析 本试验以每份样品检测费用作为成本指标，以检测时间(计孵育时间，加样和洗板时间暂不计入)作为效果指标，检测费用越少、检测时间越短表明检测效率越高。以每份样品检测费用的倒数与检测时间的倒数之积作为单位成本检测效率值，值越大表明试剂盒越好，通过比较单位成本检测效率值来判定各试剂盒优劣。

2 结果

2.1 检测结果 对实验室留存的166份血清分别采用试管凝集试验和5个厂家布病抗体cELISA试剂盒进行检测，结果见表2、表3。

表2 试管凝集试验检测结果

表3 5种试剂盒cELISA检测结果

2.2 检测结果分析 5种试剂盒的敏感性、特异性、Youden指数及AUC值见表4。由表4可知，厂家A、B、D敏感性最高(100.00%)；厂家C特异性最高(99.14%)。厂家A的Youden指数和AUC值最大，分别为95.69%和0.978，表明其诊断准确性最好、诊断价值最高。5种试剂盒的阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和阳性似然比(+LR)、阴性似然比(-LR)见表5。厂家A、C、E的PPV较高，表明检出真阳性的概率更大；厂家A、B、D的NPV均为100.00，表明检出真阴性的概率更大。厂家C的+LR最大，表明检测结果阳性时为真阳性的概率最大，即证实疾病的能力最强。厂家A、B、D的-LR均为0.00，表明检测结果阴性时为真阴性的可能性更大，即排除疾病的能力越好。

表4 5种cELISA试剂盒敏感性、特异性、Youden指数及AUC值结果

表5 5种cELISA试剂盒阳性预测值、阴性预测值和阳性似然比、阴性似然比结果

2.3 符合情况分析 5种试剂盒与SAT之间的符合情况见表6。McNemar检验结果显示，5种试剂盒中厂家B和D的检验结果与SAT结果差异显著(P<0.05)，厂家A、C和E的检验结果与SAT结果差异不显著(P>0.05)；Kappa一致性检验分析表明，5种试剂盒的检验结果与SAT结果均有高度的一致性(0.790～0.930)，其中厂家A一致性最高(0.930)。

2.4 成本-效果分析 经成本-效果分析，5种cELISA试剂盒成本-效果分析比较见表7，其中厂家A的效率最高。

表6 5种cELISA试剂盒血清学检测符合情况比较

表7 5种cELISA试剂盒成本-效果分析比较

3 讨论

经检测结果分析，厂家A、B、D敏感性最高，均为100%；厂家C特异性最高；5种试剂盒Youden指数均大于86%，表明诊断准确性较好；AUC值均大于0.9，表明诊断价值较高。厂家A、C和E PPV均大于90%，表明检出真阳性的概率更大；5种试剂盒NPV均大于95%，表明检出真阴性的概率较大。厂家C的+LR最大，表明证实疾病的能力最强；厂家A、B、D的-LR均为0，表明排除疾病的能力越好。经Kappa一致性检验分析表明，5种试剂盒与SAT结果均有高度的一致性，McNemar检验结果显示，厂家A、C和厂家E与SAT结果差异不显著(P>0.05)；厂家B和厂家D与SAT结果差异显著(P<0.05)。经成本-效果分析，单位成本检测效率值从高到低依次为A、C、B、E、D，表明厂家A的效果最好。

布病流行范围广、危害严重，是我国二类动物疫病。目前，常用的血清学诊断方法主要有RBT、SAT、CFT、iELISA和cELISA五种。由于敏感性和特异性的问题，它们都缺乏“理想检测”的质量，而且没有一种单一检测方法可以适用于所有流行病学情况[6-7]。在日常检测中以RBT和SAT为主，但2种检测方法有较高的假阳性(15%以上)和假阴性(10%以上)，往往出现漏检和误检[8]。世界动物卫生组织(OIE)陆生动物卫生法典中布病确诊指定试验为CFT或cELISA，但由于CFT操作复杂，每次检测需准备红细胞悬液和测定溶血素效价，费时费力成功率又低；而ELISA操作快速、简单，检测结果客观又可靠，且有研究证明，cELISA具有更高的特异性[6]。因此，在布病血清学确诊时亦可选择cELISA。

此外，对于不同检测目的，选择适当的检测策略(平行试验或垂直试验)也尤为重要。按照国家中长期动物疫病防治规划和国家布病防治计划，我国根据布病流行情况和防控策略实行区域化管理，全国多地主要采取“监测、扑杀、隔离、消毒”等相结合的综合性防控措施。选择合适的监测方案是防控布病的前提和关键，在监测、净化过程中使用2种或2种以上检测方法互相验证，既可减少因误杀造成的经济损失，又可降低因漏检造成布病传播风险。有研究表明，RBT和iELISA组合进行平行试验敏感性最好，SAT和cELISA组合进行垂直试验特异性最好[9]。

国家正在积极推进“布病无疫区”和“布病净化场群”的建设和评估验收，尤其是对种畜、奶畜的布病净化。在卫生疾病预防和治疗领域，往往通过成本-效益分析(Cost-benefit analysis，CBA)和成本-效果分析(Cost-effectiveness analysis，CEA)来研究和评估方案、策略，从而选出最佳方案[10]。针对养殖场的布病净化，从生物安全经济学角度来看，选择cELISA筛检，前期检测、人力成本会提高，但检测结果可信度却大大提升了，采取的针对性防控措施也更有成效，不仅可以剔除布病，还降低了养殖场生产维护成本，对控制布鲁氏菌病流行，减少经济损失，降低人感染疫病风险具有重要意义。