肺癌组织中胱硫醚-γ-裂解酶的表达及其临床意义

尹辉 王伦青 喻本桐

摘要：目的  探讨内源性硫化氢合成酶胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）在肺癌组织的表达及其临床意义。方法  选取2008年12月～2013年12月青岛大学附属青岛市市立医院经根治性肺叶手术切除并经医院病理科病理证实的肺癌患者125例，选取患者肺癌组织及癌旁正常组织各125例。应用免疫组化方法检测胱硫醚-γ-裂解酶在肺癌组织及癌旁正常组织中的表达情况，分析CSE表达与肺癌患者临床病理特征以及临床预后的关系。结果  CSE在肺癌组织中高表达占79.20%，高于癌旁正常组织的16.00%，差异有统计学意义（P<0.05）;CSE的表达情况与肺癌患者TNM分期、周围淋巴结发生转移与否、肿瘤大小、肿瘤分化程度有关（P<0.05）;CSE低表达肺癌患者5年生存率高于CSE高表达肺癌患者，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  CSE在肺癌组织中呈高表达，CSE的表达与肺癌患者TNM分期、周围淋巴结发生转移与否、肿瘤大小、肿瘤分化程度有关，CSE表达水平会对患者5年生存率造成影响，以CSE为靶点的研究思路可作为评估肺癌早期发生及预后的参考指标。

关键词：胱硫醚-γ-裂解酶;肺癌;免疫组织化学

中图分类号：R734.2                               文獻标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.06.024

文章编号：1006-1959（2020）06-0083-04

Abstract：Objective  To investigate the expression of endogenous hydrogen sulfide synthase cystathionine-γ-lyase （CSE） in lung cancer tissues and its clinical significance. Methods  From December 2008 to December 2013， 125 patients with lung cancer who underwent radical lung lobe resection and pathologically confirmed by the pathology department of the Qingdao Municipal Hospital affiliated to Qingdao University were selected， and 125 patients with lung cancer tissues and adjacent normal tissues were selected. Immunohistochemical method was used to detect the expression of cystathionine-γ-lyase in lung cancer tissues and adjacent normal tissues， and the relationship between CSE expression and clinical pathological characteristics and clinical prognosis of lung cancer patients was analyzed. Results  The high expression of CSE in lung cancer tissues accounts for 79.20%， which is higher than 16.00% of normal tissues adjacent to the cancer，the difference is statistically significant （P<0.05）; the expression of CSE is related to the TNM stage of lung cancer patients， the occurrence of peripheral lymph nodes or not， and tumor size the degree of tumor differentiation was related （P<0.05）.The 5-year survival rate of patients with low CSE lung cancer was higher than that of patients with high CSE lung cancer，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion  CSE is highly expressed in lung cancer tissues. The expression of CSE is related to the TNM stage of lung cancer patients， the presence or absence of peripheral lymph node metastasis， tumor size， and the degree of tumor differentiation. The level of CSE expression will affect the 5-year survival rate of patients.The research idea of CSE as a target can be used as a reference index to evaluate the early occurrence and prognosis of lung cancer.

Key words：Cystathionine-γ-lyase;Lung cancer;Immunohistochemistry

肺癌（lung cancer）是世最常见的，也是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）两大类，研究发现非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%。大部分肺癌患者确诊时已处于中晚期，预后很差，因此早期诊断治疗肺癌显得尤为重要。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）分子是目前研究发现的通过某种特定机制对肿瘤发生发展产生重要作用的第3种内源性气体信号分子[1]。其关键酶之一——胱硫醚γ裂解酶（CES）则主要分布在血管、肝、肺、肾等[2]。胱硫醚γ裂解酶是否可促进肺癌细胞的增殖与迁移，其与肺癌发展演变的联系值得我们深入研究，且目前有关肺癌组织与胱硫醚γ裂解酶表达的相关性研究较少，本实验主要对胱硫醚γ裂解酶在肺癌组织中表达及其临床意义作初步探究，为今后肺癌的治疗与预后评估提供新思路。

1资料与方法

1.1一般资料  选取2008年12月～2013年12月青岛大学附属青岛市市立医院医院经根治性肺叶手术切除并经医院病理科病理证实的肺癌患者125例，取其肺癌组织标本及癌旁正常肺组织上皮（癌旁正常组织距癌组织5 cm以上）进行实验。所有患者年龄45～75岁，平均年龄（60.00±15.00）岁，其中男76例，女49例。肿瘤大小≤3 cm 58例，>3 cm 67例;高分化型45例，中分化型33例，低分化型47例;浸润深度：T1～T2期72例，T3～T4期53例;淋巴结阴性74例，阳性51例，肺鳞癌72例，肺腺癌53例。随訪时间为手术当日起至末次随访时间或死亡，截止至2013年12月1日。

1.2试剂  第一抗体CSE：兔抗人CSE单克隆抗体（Boster，CN）购自武汉博士德生物工程有限公司，武汉博士德生物工程有限公司赞助提供CSE兔抗人单克隆抗体（Boster，CN），显色试剂盒DAB（AR1022）免疫组织化学染色试剂SABC（Boster，CN），枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0）;第二抗体兔抗山羊抗体、小鼠抗山羊抗体全部购置于北京中衫金桥生物技术有限公司。DAB二氨基联苯胺显色试剂盒购自梅奥森生物技术有限公司;苏木色精染液、苏木色精分色液购自北京世济合力生物科技有限公司;显微镜载、盖玻片7102型购自江苏盐城宏达医学器材有限公司;中性树脂购自上海华灵康复医学器械厂;移液器枪头、一次性塑料滴管试管购自上海麦尚科学仪器有限公司。

1.3免疫组化方法  ①离体标本以10%中性甲醛固定，接着常规行石蜡包埋，制作备用的组织蜡片并切片，②二甲苯脱蜡切片，利用梯度酒精进行水化;③使用3%H2O2-甲醇溶液在室温下进行15 min孵育;④结合在微波进行组织抗原修复后使用PBS冲洗3次×3 min;⑤取出保温箱切片，轻轻甩除血清液，然后滴加配好的一抗，加完后置于4℃冰箱，过夜;⑥用PBS冲洗滴加过一抗处理好的切片3次×5 min，用试水纸拭去切片周围的PBS液，再小心滴加二抗后放入恒温箱孵育20 min;⑦DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片;光镜观察。PBS溶液替代一抗作为空白对照，已知的阳性切片标本作阳性对照。

1.4结果判断标准  CSE染色判断标准参照文献[3]，在光镜高倍镜下颜色为棕黄色的阳性表达定位于细胞质，在400高倍镜视野下随机选取视野10个，计算肿瘤细胞中阳性表达比例计算百分率;阳性细胞数目<10%记作为（-）;阳性细胞数目在10%～25%记作为（+）;阳性细胞数目波动在25%～50%则记作为（++）;50%以上则记做为（+++）。其中（-）～（+）为低表达，（++）～（+++）为高表达。

1.5统计学方法  采用SPSS 13.0软件进行资料分析，计量资料采用（x±s）表示，计数资料采用（n）表示，行？字2检验，用Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线评估预后，用Log-rank检验分析进行生存检验。P<0.05为差异存在统计学意义。

2结果

2.1 CSE在肺癌组织及癌旁正常组织中的表达比较  CSE蛋白的阳性部位主要在细胞质中并呈棕黄色表达，其在肺癌组织中高水平表达，而在癌旁正常组织中低表达或不表达，见图1。CSE在肺癌组织中高表达占比高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 CSE表达与肺癌患者临床病理特征的关系  不同肿瘤TNM分期、周围淋巴结转移与否、分化程度及组织类型的肺癌组织中CSE表达水平比较，差异具有统计学意义（P<0.05）;不同年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小的肺癌组织中CSE表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3 CSE与肺癌患者预后的关系  125例肺癌患者中，CSE高表达患者5年生存率低于CSE低表达患者，且两者的5年生存率比较，差异具有统计学意义（？字2=8.884，P=0.003），见图2。

3 讨论

世界上最常见的肺恶性肿瘤因其早期发现难度大、恶性程度高的特点成为对人类身体健康影响最大的恶性肿瘤之一[4]。研究发现，新型分子硫化氢作为信号分子对调节人体机体生理代谢具有重要作用，其生成主要通过组织器官的代谢形成，硫化氢及其酶在内分泌、心血管、神经、呼吸、消化等系统中具有调节人体代谢过程和组织功能。胱硫醚-β合成酶（CBS）、胱硫醚γ裂解酶（CSE）在人体组织细胞中的存在位置具有明显组织差异性，譬如主动脉、肠系膜动脉、肺动脉存在胱硫醚γ裂解酶的表达却无胱硫醚-β合成酶分布[5]。而硫化氢与恶性肿瘤的发生发展过程关系密切，硫化氢及其酶是通过促进微血管形成、正常血管结构的保持、抑制心肌细胞和抑制肿瘤细胞凋亡等作用来发挥生理作用。内源性硫化氢在肿瘤发生发展过程中通过介导血管生成调节线粒体生物能、加速细胞周期进程及抗细胞凋亡机制等来发挥功能。胱硫醚γ裂解酶在多数恶性肿瘤中表达上调，并且与癌症侵袭及预后不良密切相关。Cai WJ等研究[8]发现，CBS和CSE在人结肠癌细胞株HCTll6和SW480中的可产生硫化氢分子，作为外源性硫化氢供体——NaHS也能加速Akt和ERK磷酸化水平，进行浓度依赖性的促进细胞增殖，肿瘤细胞内G0/G1期之比降低，因而进入S细胞数量增多。NaHS进行干预后周期素依赖性蛋白激酶抑制因子p21w/Cipl和NO的表达存在一定的降低。Cao QH等[9]研究发现，CSE和CBS在丁酸盐处理后刺激结肠癌细胞引起表达量的增高，并加速ERK的磷酸化水平情况来调节内源性H2S的表达水平，从而抑制结肠癌细胞生长转移过程。张广松等[10]在研究膀胱肿瘤中发现硫化氢与其他气体分子共同促进生成肿瘤组织营养血管，硫化氢及其合成酶有助于膀胱肿瘤细胞的生长并可抗拒化疗药物的药理作用。本研究结果显示，CSE在肺癌组织中高表达占比高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05），不同肿瘤TNM分期、周围淋巴结转移与否、分化程度及组织类型的肺癌组织中CSE表达水平比较，差异具有统计学意义（P<0.05）;不同年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小的肺癌组织中CSE表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;CSE高表达患者5年生存率低于CSE低表达患者，且两者的5年生存率比较，差异具有统计学意义（？字2=8.884，P=0.003）。表明CSE在肺癌的发生浸润转移演变过程中具有重要作用，很有可能是促进肺癌发展演变的重要途径之一，其发生机制将是下一步的研究重点。

内源性硫化氢与CO和NO相互作用可促进肿瘤演变过程[11]，CO和NO通过非cGMP和cGMP的信号分子途径促进血管生长，这提示在肺癌发生发展过程中，硫化氢或其合成酶可能与其他气体分子有利于营养血管生成。硫化氢的表达同P13K/Akt信号通路具有明显相关性，有研究就硫化氢及CSE基因表达与肿瘤细胞增殖调控进行探究，但其具体的信号通路尚未被发现。从理论上讲，硫化氢确实存在调节血管内皮细胞生长因子的功能，并通过促进这些生长因子生成血管新生[12，13]，但具体增殖侵润的调控机制不明。同时，P13K/Akt信号通路的存在对人体内肿瘤细胞生成具有重要意义[14]，因此本研究推测内源性硫化氢及其酶可能通过对调节P13K/Akt信号通路从而调控肿瘤细胞的增殖凋亡。在转录和翻译水平上，P13K/Akt信号通路可发生过度激活后，从而导致肿瘤细胞的增殖生长失去免疫系统的监控和控制。

综上所述，CSE在肺癌组织中呈高表达，CSE的表达与肺癌患者TNM分期、周围淋巴结发生转移与否、肿瘤大小、肿瘤分化程度有关，CSE表达水平会对患者5年生存率造成影响，以CSE为靶点的研究思路可作为评估肺癌早期发生及预后的参考指标。

参考文献：

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[9]Cao Q，Zhang L，Yang G，et al.Butyrate-stimulated H2S production in colon cancer cells[J].Antioxid Redox Signal，2010，12（9）：1101-1109.

[10]張广松，刘阳，庄宝祥，等.胱硫醚-γ-裂解酶在膀胱移行上皮癌中表达的研究[J].中国现代医药杂志，2015，17（6）：8-10.

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收稿日期：2019-11-27;修回日期：2019-12-09

编辑/成森