猪伪狂犬病毒PCR检测方法的优化

王豕辰，孙 彤，董 恒，侯晓林

（北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

猪伪狂犬病是一种疱疹病毒性疾病，是导致猪繁殖失败并给养猪业带来巨大经济损失的主要病原体之一[1]。其特征在于妊娠母猪流产，公猪不育等。猪伪狂犬病不易与猪瘟、细小病毒感染等病区别开，需要实验室检查确诊[2]。核酸研究方法在许多领域都得到了广泛的应用，为了提高PCR的检测准确度，实验对PCR扩增条件进行了优化并且检测了特异性。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肾细胞PV-15为实验室保存细胞株；伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒Ⅰ型（PCV1）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）均为实验室保存毒株；DMEM高糖培养基（DMEM）、胎牛血清(FBS)；青链霉素和0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国HyClone公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR反应试剂盒购自上海生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及扩毒

调整PV-15细胞个数为1h106个/mL接种于25 cm2细胞培养瓶中，放入37 ℃、5%CO2培养12 h，待细胞长成单层后，吸弃培养基，PBS清洗2次，每次1 min，接毒量为10TCID50，放入37 ℃、5%CO2培养1 h，吸弃病毒，PBS清洗两次，每次1 min，加入含3%血清的培养基，放入37 ℃、5%CO2培养48 h，终止培养。采用反复冻融法破裂细胞，-20 ℃反复冻融3次后，将细胞瓶内液体全部转移到15 mL离心管中于600 g离心5 min，收集上清（病毒液），置于-80 ℃保存。

1.2.2 病毒DNA提取

此过程根据试剂盒提供说明书进行操作。向干净的1.5 mL离心管中加入20μL Prteinase K然后加入200μL病毒液，再加入200μL Carrier RNA工作液（缓冲溶液GB:Carrier RNA=1 100:31比例配置）。盖紧管盖置于涡旋振荡机上震荡15 s使管内溶液充分混合。将离心管置于56 ℃恒温水浴锅中孵育15 min后短暂离心15 s。向管中加入250μL无水乙醇，涡旋振荡机上震荡15 s，然后静置5 min后短暂离心15 s。将离心管中所有液体全部转移至RNase-Free吸附柱CR2上后，6 000 g离心1 min。500μL溶液GD洗涤一次，然后600μL溶液PW洗涤2次，洗涤离心条件同上。洗涤后向管中加入500μL乙醇，13 000 g离心3 min，然后小心打开吸附柱的盖子，室温放置1 min，使吸附膜的完全变干后，加入100μL RNase-Free ddH2O，盖紧管盖，静置5 min后，13 000 g离心1 min，收集洗脱液（含有病毒DNA），-80 ℃保存。

1.2.3 引物的设计与合成

伪狂犬病毒引物使用根据国标方法，扩增伪狂犬病毒基因中434-651碱基对（bp）之间217bp基因片段，由生工生物（上海）股份有限公司合成，其序列为：

P1：5ÿ-CAGGAGGACGAGC TGGGGCT-3’；

P2：5ÿ-GTCCACGCCCCGCT TGAAGCT-3’。

1.2.4 PCR条件的优化

此过程根据试剂盒提供说明书进行操作，实验室PCR反应采用25μL反应体系，加入PCR MIX 2.5μL，FORWARD PRIMER(10 mmol/L) 12.5μL，REVERSE PRIMER(10 mmol/l)0.1μL，DNA 模 板 0.1μL，ddH2O添加至25μL。调整扩增各参数进行反应条件优化。

1.2.5 PCR特异性试验

利用优化后的条件对PRV、PPV、PCV1和PCV2分 别 进 行PCR扩增，以鉴定其特异性。

1.2.6 PCR产物检测

通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析扩增反应产物。电泳缓冲液为1xTAE，电压为220 V，反应时间为35 min。电泳反应结束后，立即使用凝胶成像系统对实验品进行照相记录并分析扩增产物带。

2 结果

2.1 PRV PCR反应条件优化结果

经过对扩增各参数多次进行优化，结果如图1所示，当退火温度为62.5 ℃至63.5 ℃时，在217 bp处出现明细的扩增片段，且无杂带，扩增效果最佳。94 ℃ 3 min变性，94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 5 min。

2.2 PRV PCR特异性结果

采用优化过的PCR方法对PRV、PPV、PCV1和PCV2分别进行PCR扩增，结果如图2所示，只有PRV在217bp处出现扩增片段，而PPV、PCV1和PCV2均未出现扩增片段。

图1 不同扩增参数对PRV PCR的影响

图2 PRV PCR特异性检测电泳图

3 讨论

近年来，病毒性疾病已成为现代养猪业发展的主要威胁。尤其是由PRV等引起的呼吸和生殖系统疾病越来越普遍，给养猪业带来了巨大的经济损失[3]。由于发病猪临床症状与猪细小病毒，猪瘟病毒等感染相似，所以必须进行实验室检测后才可以确诊[4]。因此建立一个特异检测PRV的方法是十分必要的。

在实践中，PCR可能由于各种原因而失败，其中引物的非特异性结合是比较常见的[5]。因此，已经开发出许多技术和程序来优化PCR条件。退火是PCR中关键的一步，是引物与DNA链的结合。退火的温度对PCR的特异性有巨大影响[6]。退火的温度需要从多方面去决定，一般是根据引物的最适温度（Tm）值来设计温度以便保证扩增效果达到理想[7]。此实验中根据引物Tm值选择了16个退火温度，通过电泳检测到当退火温度介于62.5 ℃至63.5 ℃之间时，目的基因片段扩增明显且没有杂带，并且通过特异性检测证实该反应条件下，只有PRV目的基因可以扩增，PPV、PCV1和PCV2均呈现阴性。

总之，PCR是快速、特异的检测PRV感染的技术，实验所优化方法可以为今后实验室检测PRV提供一种新的参考。