黄肝煎液中主要成分的鉴别与含量测定

雷亚亚， 郝秀娟， 高 婷， 陈 晶， 李建理

（宁夏医科大学总医院制剂中心，银川 750004）

黄肝煎液是宁夏医科大学总医院特色制剂之一，具有清热、利湿、退黄功效，主要用于治疗急慢性黄疸性肝炎。方中茵陈促进胆酸和胆红素代谢，具有保肝利胆作用[1-3]。大黄可增加肠蠕动、促进排便、减少胆红素的重吸收、利胆退黄之功效[4-6]。黄芩具有抗氧化、抗病毒、保护肝细胞活性作用[7-9]。当归可促进胆酸排出，保护细胞ATP 酶、葡萄糖-6-磷酸酶、5-核苷酸酶[10]。然而，关于该制剂质量控制尚不完善。本文在现有研究基础上，采用薄层色谱法对黄肝煎液中成药大黄及当归进行定性鉴别；采用HPLC 双波长法同时测定茵陈中绿原酸、黄芩中的黄芩苷及大黄中的大黄素与大黄酚的含量，建立含量测定方法，使原有质量评价体系得到提高与完善，确保黄肝煎液质量稳定可控。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Waters 2489 紫外检测器，1525 泵）；MS105DU 型分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；PHS-3C 酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂分厂，规格：100×100 mm，批号：20170106）。

1.2 药品与试剂

黄肝煎液（批号：181220、190111、190125）。大黄素（批号：110758-201512），大黄酚（批号：110796-201621），绿原酸（批号：110753-201716）均由中国药品生物制品检定所提供。黄芩苷（批号：JZ18041002）由南京景竹生物科技有限公司提供。大黄对照药材（批号：2330017071），当归对照药材（批号：2390017101），茵陈对照药材（批号：3630017121），黄芩对照药材（批号：2830017 112）等来自河北双宁药业有限公司。乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 当归的薄层色谱鉴别 取本品20 mL，用乙醚振摇提取2 次，每次40 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 mL，超声10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，作为对照药材溶液。按处方量称取缺当归的其余药材，同供试品煎煮法煎制阴性对照，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂展开、取出、晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，见图1。

2.1.2 大黄的薄层色谱鉴别 取本品30 mL，用乙醚振摇提取2 次，每次20 mL，合并乙醚液，挥发至约1 mL，作为供试品溶液。取大黄对照药材0.5 g，加乙醚20 mL，超声20 min，滤过，滤液挥发至约1 mL，作为对照药材溶液。按处方量称取缺大黄的其余药材，同供试品煎煮法煎制阴性对照，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。另取大黄素，大黄酚对照品，分别加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述5 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（75∶24∶1）为展开剂[11]，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，见图2。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 YMC-Pack Pro C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；大黄素、大黄酚检测波长为254 nm，绿原酸、黄芩苷检测波长为327 nm；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脱：0～8 min，（A∶B=18∶82），18～28 min（A∶B=85∶15），28～30 min（A∶B=18∶82）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：35 ℃。2.2.2 溶液制备

1）对照品储备液：精密称取绿原酸对照品5.0 mg ，黄芩苷对照品5.0 mg，大黄素对照品5.0 mg，大黄酚对照品4.0 mg，置于25 mL 的量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀；精密量取其5 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀得混合对照品溶液。

2）供试品溶液：精密量取本品10 mL，精密加入甲醇40 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过。①精密量取续滤液5 mL，用甲醇定容至10 mL 并摇匀。②精密量取续滤液10 mL，挥去甲醇，加入2.5 mol·L-1硫酸溶液10 mL，超声处理5 min，再加入三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，冷却，转移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，合并至分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液用三氯甲烷提取2 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液并挥干，残渣加甲醇使溶解并转移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度并摇匀[12-14]。将步骤①②所得待测溶液按比例混合，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

3）阴性对照溶液：照黄肝煎液处方，除茵陈、大黄、黄芩外，称取处方量的其余药，按供试品煎煮方法制备阴性对照品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。2.2.3 方法学验证

2.2.3.1 专属性试验结果 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μL，按照上述色谱条件测定。结果阴性样品无干扰，表明该方法专属性良好，色谱见图3。样品中4 种被测成分峰与相邻峰的分离度R＞1.5，理论板数均大于3000。

2.2.3.2 线性关系考察结果 精密移取对照品储备液0.1、0.4、1.0、2.0 和4.0 mL 置10 mL 量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀得系列标准曲线溶液。按色谱条件分别进样，以峰面积为纵坐标，以对照品的浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。表明4 种化合物在各自的浓度范围内线性关系良好。

表1 线性关系考察

2.2.3.3 精密度实验结果 取同一对照品溶液连续进样6 次，记录峰面积，得到绿原酸、黄芩苷、大黄素、大黄酚峰的RSD 分别是1.38%、1.16%、1.37%和1.49%。结果表明，仪器的精密度较好。

2.2.3.4 稳定性实验结果 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、12 和24 h 测定，测得绿原酸、黄芩苷、大黄素、大黄酚的RSD 分别为1.59%、1.40%、2.38%和1.98%。结果表明，供试品溶液中的绿原酸、黄芩苷、大黄素和大黄酚在24 h 内比较稳定。

2.2.3.5 重复性实验结果 按供试品溶液制备方法平行制备6 份供试品溶液，进行检测，记录各组分色谱峰面积。测得绿原酸、黄芩苷、大黄素、大黄酚的RSD 分别为1.56%、2.04%、2.08%和1.97%，表明方法重复性良好。

2.2.3.6 回收率试验结果 按供试品溶液制备方法制备6 份供试品溶液，分别添加相当于标示量为100%的对照品，参照相应测定方法测定绿原酸、黄芩苷、大黄素及大黄酚的含量，并计算回收率，见表2，平均回收率分别为100.5%、101.3%、99.6%、99.8%，RSD 分别为1.68%、1.56%，1.38%和2.14%。

2.2.3.7 样品测定结果 取3 批黄肝煎液样品，按供试品溶液制备方法处理。取对照品溶液及供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算黄肝煎液中绿原酸、黄芩苷、大黄素及大黄酚的含量，见表3。

表2 加样回收试验结果（n=6）

表3 样品含量测定结果（mg·mL-1，n=3）

3 讨论

大黄薄层鉴别试验中，初期以乙酸乙酯为萃取溶剂，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15∶5∶1 为展开剂，出现斑点颜色不一致、斑点拖尾、干扰较大等现象。尝试换用不同萃取溶剂、不同展开剂及对供试品酸化处理，结果展开剂的组成对结果影响最为显著，最终参考药典收录的小儿热速清糖浆中大黄鉴别方法，以乙醚为萃取溶剂，甲苯-乙酸乙酯-甲酸=75∶24∶1 为展开剂，结果斑点清晰，专属性强，TLC 图谱较为理想[11]。

HPLC 含量测定中，流动相考察了甲醇-水、乙腈-水不同组成与比例，以及用磷酸、甲酸调节酸度，结果显示以乙腈-0.1%磷酸水为流动相峰型最好。

本课题期望能够同时测定4 种成分含量，但配方中含有中药10 余味，阴性干扰较大，在同一波长下无法实现同时检测，故考虑双波长检测。为确保化合物之间良好的分离度，参考各化合物的最大吸收波长，最终确定大黄素和大黄酚的检测波长为254 nm，绿原酸和黄芩苷的检测波长为327 nm。

根据化合物的性质，确保组分间良好的分离度与适当的保留时间，采用梯度洗脱。

中药制剂质量检测标准正走向规范，中药制剂现代化提出多指标控制质量的方法，含量测定项指标化学成分的选择要以中药君臣佐使为依据。本文针对医院制剂黄肝煎液现有质量标准单一等问题，建立了多指标含量测定及鉴别的质量标准体系，增加制剂质量的可控性，确保批次间的稳定，保证中药制剂的安全有效。

综上所述，本文建立的定性定量方法专属性强，操作简单，结果准确，可用于黄肝煎液的质量控制。