锌指蛋白545对结直肠癌上皮间质转化和迁移侵袭的影响

潘烽平 陈一鹏 李彦 张明明

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤[1-2]。肿瘤细胞早期侵袭和转移是结直肠癌患者的主要死亡原因[3]。因此，深入研究结直肠癌侵袭和转移的分子机制具有重要意义。锌指蛋白545（ZNF545）是一种转录因子，参与调节细胞增殖、分化和转移等过程。近期研究表明，ZNF545在多种肿瘤发生、发展过程中具有重要作用[4-6]。本课题组前期研究结果提示，ZNF545在结直肠癌组织中的表达异常缺失，并与肿瘤发生、发展及患者的预后显著相关[7]。然而，ZNF545在结直肠癌上皮间质转化（EMT）和侵袭转移中的作用及其分子机制尚不明确。因此，笔者研究了ZNF545对结直肠癌细胞EMT的调控以及迁移和侵袭能力的影响，并探索可能的分子机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 人结直肠癌细胞株及培养 人结直肠癌细胞株SW480、Caco2、Lovo和HCT116购自上海中国科学院研究所。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2 质粒构建和细胞转染 先采用免疫印迹试验检测 4 株结直肠癌细胞 SW480、Lovo、Caco2、HCT116 中ZNF545表达水平。选取内源性ZNF545高表达的细胞用于敲低实验，低表达的细胞用于过表达实验。由上海吉凯公司设计并合成特异性沉默ZNF545的siRNA（siRNA-ZNF545）及阴性对照siRNA（siRNA-control），采用Lipofectamin 2000（Invitrogen公司）将siRNA转染内源性ZNF545高表达的SW480细胞。过表达ZNF545的质粒（pcDNA3.1-ZNF545）及对照质粒（pcDNA3.1-control）购自上海吉凯公司，采用Lipofectamin 2000将质粒转染内源性ZNF545低表达的HCT116细胞。

1.3 ZNF545对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响 采用Transwell小室实验。将各组细胞分别饥饿12h，经消化、离心重悬，以1×105个/ml的细胞密度重悬于200μl无血清培养基中，均匀铺于Transwell小室的上室，并在下室加入400μl含10%胎牛血清的培养基；培养48h后，甲醇固定Transwell小室的下层细胞，结晶紫染色、清水冲洗，最后用棉签轻轻拭去上层细胞，在显微镜下观察、拍照。细胞侵袭实验除采用基质胶（Matrigel胶）包被的Transwell小室外，其余步骤同迁移实验。

1.4 EMT相关分子标志物蛋白表达检测 采用免疫印迹试验。取对数生长期的细胞，加入适量含有蛋白酶抑制剂（PMSF）的细胞裂解液（RIPA）提取细胞总蛋白，离心取上清液。采用蛋白浓度测定（BCA）法检测蛋白浓度，加入样本缓冲液后煮沸变性。取50μg蛋白样品进行上样，采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转至聚偏氟乙烯膜，再用5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入ZNF545（1∶1 000，英国 Abcam 公司）、E 钙黏蛋白（E-cadherin）（1∶1 000，英国 Abcam 公司）、磷酸化锌指转录因子（slug，1∶1 000，英国 Abcam 公司）和磷酸甘油醛脱氢酶（1∶100，英国 Abcam 公司）抗体，于 4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜后加入过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠二抗（1∶1 000，英国 Abcam 公司），室温孵育 2h。TBST 缓冲液洗膜后，使用化学发光试剂发光显影。

1.5 ZNF545表达变化对结直肠癌细胞E-cadherin表达的影响 采用细胞免疫荧光检测。细胞成功爬片后，甲醛固定（室温，30min）；滴加ZNF545一抗液，将玻片平置于湿盒内，4℃过夜；加入异硫氰酸荧光素-兔抗鼠免疫球蛋白G抗体，室温孵育2h；再用荧光染料（DAPI）复染，冲洗后封片，在荧光显微镜高倍镜下观察拍照。

1.6 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZNF545在结直肠癌细胞系中的表达 内源性ZNF545蛋白在SW480细胞中表达最高，在Lovo、Caco2细胞中的表达次之，在HCT116细胞中表达最低，见图1。故本研究挑选了内源性ZNF545高表达的SW480细胞用于敲低实验，低表达的HCT116细胞用于过表达实验。

图1 SW480、Lovo、Caco2、HCT116中 ZNF545 蛋白表达电泳图

2.2 ZNF545对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响 过表达ZNF545后，HCT116细胞迁移和侵袭能力明显减弱，穿过小室基底膜的平均细胞数明显减少（P＜0.01），见图2a（插页）；敲低ZNF545表达后SW480细胞迁移和侵袭能力明显增强，穿过小室基底膜的平均细胞数明显增多（P＜0.01），见图 2b（插页）。

图2 ZNF545对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响（a：过表达ZNF545抑制肠癌细胞的迁移和侵袭能力；b：敲低ZNF545表达后增强肠癌细胞的迁移和侵袭能力）

2.3 ZNF545对EMT相关分子标志物的影响 过表达ZNF545明显增加肿瘤侵袭转移相关的关键抑癌基因E-cadherin的表达，同时抑制E-cadherin的转录抑制因子slug的表达，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图3a。敲低ZNF545表达后抑制E-cadherin的表达，同时增加slug的表达，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图3b。

图3 ZNF545对EMT相关分子标志物的影响（a：过表达ZNF545抑制肠癌细胞中slug的表达，增加E-cadherin的表达；b：敲低ZNF545表达后增加肠癌细胞中slug的表达，抑制E-cadherin的表达）

2.4 ZNF545表达变化对结直肠癌细胞E-cadherin表达的影响 与空白对照组（HCT116组）及阴性对照组（NC组）比较，HCT116过表达ZNF545组（ZNF545组）E-cadherin的表达明显增加，见图4a（插页）。与空白对照组（SW480组）及阴性对照组（si-NC组）比较，SW480敲低ZNF545组（si-ZNF545组）E-cadherin的表达明显减少，见图4b（插页）。

图4 ZNF545表达变化对结直肠癌细胞E-cadherin表达的影响（a：过表达ZNF545增加E-caherin表达；b：敲低ZNF545表达后抑制E-caherin表达；细胞免疫荧光检测）

3 讨论

恶性肿瘤的EMT行为是近年来确定的、与肿瘤增殖、侵袭、转移密切相关的生物学过程[8]。通过EMT，上皮细胞可转化为具有抗凋亡、降解细胞外基质、极性丢失、促侵袭转移等特性的间充质表型细胞[9-10]。近年来，关于EMT与肠癌细胞侵袭和转移的关系研究增多，相关研究发现肠癌中普遍存在上皮标志物E-cadherin的表达丢失以及间充质标志物波形蛋白Vimentin、β-链蛋白（β-catenin）、N-cadherin和E-cadherin的转录抑制因子slug、ZEB1/ZEB2表达升高[11-12]。由于基因突变、表达丢失等原因导致的关键抑癌基因功能缺失而引起上述EMT关键分子的表达改变，在驱动肠癌的侵袭、转移过程中发挥着重要作用。

ZNF545是新发现的KRAB型锌指转录因子。有研究提示，ZNF545在人正常组织中广泛表达；但在肝癌[13-14]、胃癌[4]、乳腺癌[15]及结直肠癌[16]组织中由于其启动子区CpG岛的异常甲基化，导致ZNF545表达缺失。但目前尚无关于ZNF545在结直肠癌EMT和侵袭转移中作用的相关报道。本研究首先检测了ZNF545在各结直肠癌细胞系中的表达，然后挑选了内源性ZNF545高表达的SW480细胞用于敲低实验；内源性ZNF545低表达的HCT116细胞用于过表达实验。通过Transwll小室实验检测ZNF545对结直肠癌细胞的影响，发现沉默ZNF545可以显著增强细胞的迁移和侵袭能力，而过表达ZNF545则显著降低细胞的迁移和侵袭能力。免疫印迹试验检测发现，沉默ZNF545可增加间质标志物slug蛋白的表达，同时抑制上皮标志物E-cadherin的表达；过表达ZNF545则抑制slug的表达，同时增加E-cadherin的表达。细胞免疫荧光实验进一步证实，ZNF545能够调控E-cadherin的表达。上述实验结果证明，结直肠癌组织中ZNF545的缺失表达，可能通过诱导结直肠癌EMT从而促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。在结直肠癌组织中，ZNF545启动子的异常甲基化导致ZNF545低表达，进而激活结直肠癌细胞EMT转化，增强肿瘤细胞的转移能力。因此，ZNF545在结直肠癌的发生、发展过程中扮演了重要的角色。

综上所述，ZNF545在结直肠癌的进展过程中发挥抑癌基因的作用，通过抑制EMT而降低结直肠癌细胞迁移和侵袭能力，靶向调控ZNF545表达可能为结直肠癌的防治提供新的方向。