小鼠股骨远端缺损植入模型的构建

孙莹霄，廖 赟，欧阳丽萍，宋文刚

(1.北华大学 药学院，吉林 吉林 132013；2.上海交通大学医学院附属同仁医院 药学部，上海 200336)

骨缺损人工植入材料是在出现不能自愈的骨缺损问题后植入患处起修复、填充、固定和支撑等作用的医用材料[1].目前，科研人员一直致力于开发具有能够满足细胞及血管生长要求的人工植入材料，不断提高其生物性能[2].高分子材料在生产实践中应用广泛[3]，聚醚醚酮(PEEK)是一种高分子半晶体聚合物[4]，其弹性模量介于3～4 GPa之间，相较于传统钛合金更接近骨组织[5-6].PEEK具有良好的耐腐蚀性、射线可透过性，对影像学评估影响较小[7-8].课题组前期研究发现，经浓硫酸处理后的磺化PEEK具有三维孔道结构，对PEEK材料的抗菌和成骨性能均有所改善，需进一步进行临床前动物试验评价[9].目前，以长骨为植入位置的骨缺损模型研究较少，操作难度较大，提供一种用来评价植入材料骨修复性能的小鼠股骨远端骨缺损模型.

骨损伤修复涉及一系列复杂的生理和病理过程.骨骼是高度血管化的器官，骨修复与血管生成密不可分.2014年Ralf Adams团队[10]在Natrue发文提出，骨组织的血管系统存在两种血管亚型，即H型和L型，并证实H型血管(CD31hiendomucinhivessel，HV)与机体成骨功能存在明显的正相关.HV具有独特的形态结构和功能特性，主要分布在胫骨干骺端和股骨内膜附近的小梁骨周围[11]，而股骨远端与胫骨相比具有更大的直径，更有利于作为植入位置评价植入材料的生物相容性.

选用具有抗菌性且透射线性的磺化PEEK做为植入材料，应用C57BL/6J雌性小鼠为模型动物，以H型血管丰富的股骨远端为植入部位，构建一种适用于评价植入材料生物性能的股骨远端骨缺损植入模型，为新型植入材料的开发及应用提供合适的动物模型.

1 材料与方法

1.1 实验动物

由上海南方模式动物实验中心提供雌性7周龄C57BL/6J小鼠3只，体重为18～20 g，小鼠自由进食并观察一周，无异常后进行实验.

1.2 实验材料与设备

电子天平(上海精天FA200)，micro-CT成像仪(Scanco viva40，瑞士)，电钻(Dremel Sty-LusTM 1100-01，美国)，扫描电子显微镜(FE-SEM，Hitachi S-4800，Japan)，磁力搅拌器，聚醚醚酮(江苏君华)，戊巴比妥钠(北京普博斯生物)，75%乙醇，生理盐水(上海现代哈森药业有限公司)，注射用青霉素钠(华北制药).

1.3 实验材料与设备

使用浓硫酸对PEEK进行磺化处理，具体步骤如下：在烧杯中加入适量浓硫酸，并置于磁力搅拌器上.将PEEK棒材(直径1 mm、长度5 mm)放入烧杯，打开磁力搅拌器调节至合适转速(确保PEEK在磺化过程中不黏连)，室温下处理10 min.用超纯水清洗磺化后的材料3遍，晾干备用.将磺化聚醚醚酮置于容积为200 mL的反应釜中，加入70 mL超纯水，120 ℃水热处理4 h.水热处理后，磺化聚醚醚酮取出并用超纯水清洗3遍，晾干备用.植入前，使用酒精灭菌24 h后置于无菌器皿内备用.

1.4 植入模型的构建

手术器械消毒：手术用镊子，剪刀，持针器，钻头，等手术器械高温消毒2 h后置于无菌器皿内备用.麻醉：配制1%的戊巴比妥钠备用.用天平称量小鼠体重，并按20 mg/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠.备皮：用剃毛器剃除小鼠手术部位及周边的被毛；用75%的酒精棉球和碘伏分别擦拭手术部位及周边皮肤3次.暴露股骨远端：将小鼠截石位屈膝置于手术操作台上.沿股骨方向剪开膝关节外皮肤，并适当撑开.在膝关节髌韧带内侧斜上方将股三头肌向外侧翻开暴露股骨远端.开孔：先用低速骨钻在股骨远端髁间钻直径0.4 mm的圆孔缺损，更换0.8 mm钻头进一步将圆孔扩大至1.0 mm直径.植入材料：将灭菌后的磺化聚醚醚酮材料由上述圆孔小心地置入股骨骨髓腔内.消毒缝合：无菌生理盐水冲洗伤口，滴加青霉素钠溶液(8万单位)消毒，缝合伤口.小鼠给予充足的食物和水喂养.术后肌肉注射青霉素8万单位/d，连续3 d.

1.5 观察项目与检测方法

术后观察小鼠健康情况和后肢膝关节活动情况.2周后，处死小鼠，并分离小鼠股骨，观察小鼠股骨远端外观.采用micro-CT成像技术分析小鼠股骨缺损模型：使用三维重建观察材料的植入位置和骨小梁微结构的改变，并分析计算骨小梁参数.

1.6 统计学处理

2 结果与分析

2.1 磺化PEEK扫描电镜的形貌表征

如图1左所示，在扫描电镜下观察PEEK表面平坦致密无孔洞；图1右所示磺化PEEK表面呈均匀疏松多孔的网状结构.扫描电镜结果表明应用浓硫酸成功将PEEK磺化.

图1 材料表面形貌

2.2 股骨远端植入模型的构建

小鼠截石位屈膝在膝关节处沿股骨方向剪开皮肤，皮肤开口长度约0.5 cm，如图2a所示，白色长条组织为髌韧带.由膝关节内侧向外侧翻开肌肉见股骨远端，股骨远端两侧突起结构为股骨髁,见图2b中黑色箭头所示.如图2c～d所示，两侧骨股髁中点为圆点用电钻钻开1 mm直径的圆孔缺损，圆孔缺损在股骨远端中央位置，除股骨位置以外未造成其他缺损.如图2e所示，将材料置入圆孔内，复位侧翻的股三头肌及髌骨，如图2f所示，小鼠膝关节无异常错位现象，如图2g所示，关闭小鼠创口后，小鼠创面无出血.

(a)剪开皮肤

(b)暴露股骨远端

(c)钻孔

(d)钻孔

(e)植入材料

(f)复位

(g)关闭创口图2 小鼠股骨远端骨缺损模型的构建

2.3 小鼠术后活动情况

在小鼠股骨远端造成开放性创伤，若造成小鼠腿部活动受限，将影响小鼠正常饮食，造成植入材料的体内评估出现误差.观察发现实验小鼠行单侧股骨远端植入模型手术后小鼠膝关节活动正常，小鼠饮食行动均正常，所有小鼠存活至取材.

2.4 鼠股骨骨缺损模型外观形态

植入2周后，将小鼠处死并分离取出股骨.如图3所示，右侧为股骨远端，黑框内所示为植入材料位置，植入区域的颜色较浅.小鼠股骨骨干完整，股骨远端组织结构无明显缺损，植入材料位于股骨远端骨髓腔内.

图3 股骨骨缺损模型外观照片

2.5 micro-CT扫描三维骨结构

micro-CT扫描结果如图4所示.

图4 股骨远端micro-CT三维图片

图4右显示，植入材料位于股骨远端至小鼠股骨骨髓腔内，两组骨小梁结构相对比，图4左图像显示对照组股骨不规则细丝状的骨小梁结构，模型组股骨内有隐约可见的骨小梁结构.

2.6 骨小梁分析

骨小梁数量分析结果如图5所示，模型组小鼠骨小梁数量较对照组骨小梁数量显著性降低(t检验，P<0.05).骨小梁体积分析结果如图6所示，模型组骨小梁体积与对照组骨小梁体积比较，模型组骨小梁体积低于对照组(t检验，P<0.001).

图5 骨小梁数量

图6 骨小梁体积

3 结 论

理论上大型动物如犬、猪、羊等与人体骨组织结构类似，是研究骨骼愈合机制的理想实验动物.然而，大型动物实验成本高，并且其骨组织愈合能力慢，实验周期长.常用来构建骨缺损模型的小型动物主要有小鼠、大鼠、兔等.鼠科动物不仅具有较强的抗感染能力，且围手术期易于管理[12]，因此鼠科动物常被用来研究材料对骨缺损的修复能力.实验动物的年龄也是影响实验结果准性的因素.为避免生长情况对实验结果准确性的影响，本实验选用8周龄雌性C57BL /6J小鼠作为实验动物.

动物模型是医药产业发展的支撑条件，构建合适的动物模型是准确评价植入材料生物相容性的关键[13].评价植入材料的体内生物性能常选取的模型部位主要有牙槽骨、颅骨、胫骨、椎骨、股骨等[14-15].本实验选择股骨远端作为损伤部位主要有两方面原因：小鼠颅骨、胫骨、牙槽骨等部位手术操作困难；研究发现，H血管在股骨远端含量丰富[6]，因此选取股骨远端作为损伤植入部位不仅利于材料对骨影响的评价，而且可对骨特异性H血管进行分析.

PEEK具有耐腐蚀，弹性模量与骨相近的特点已作为医用材料应用于临床[16-17].然而，PEEK的生物相融性、骨整合能力等方面仍有待进一步提高.研究发现浓硫酸处理后的磺化PEEK具有三维孔道结构[18-19]，对PEEK材料的抗菌和成骨性能均有所改善[7].其表面的三维孔道结构又可以作为促成骨药物载体进一步提高生物活性及成骨性能[20-21]，需开展有效的动物实验为磺化PEEK的临床应用提供研究基础.

为避免开孔造成股骨断裂，采用多尺寸钻头循序渐进的方式进行开孔.先用0.4 mm直径的钻头在股骨远端中间位置初步钻一个圆孔缺损，再使用0.8 mm钻头扩大到1.0 mm.术后观察显示，小鼠活动自由未发生感染；micro-CT扫描成像分析结果显示植入材料位于股骨骨髓腔内，模型组小鼠骨小梁数量及骨小梁体积较对照组有明显差异.上述结果表明使用多尺寸钻头循序渐进的方式进行开孔可成功构建小鼠股骨远端骨缺损模型且不会造成股骨断裂.

综上所述：使用多尺寸钻头循序渐进的方式进行开孔可在8周龄雌性C57BL /6J小鼠股骨远端成功构建骨缺损.植入磺化PEEK棒，小鼠股骨未发生骨折现象，术后小鼠活动饮食均未受影响，说明股骨远端骨缺损模型构建成功.