桑白皮水煎液及各性味拆分组分对典型热证模型物质能量代谢的影响❋

杨翠兰，克迎迎，李亚格，袁培培，傅 阳，冯卫生，郑晓珂Δ

(1. 河南中医药大学， 郑州 450046； 2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，郑州 450046)

中药四性是指寒、热、温、凉4种药性，它反映了药物影响人体阴阳盛衰、寒热变化方面的作用倾向[1-2]。本项目首席科学家匡海学教授提出，药性(气)是药物通过不同途径，以主要影响机体的能量代谢、物质代谢为特征的，与治疗作用有关或无关的，但均可影响药物疗效发挥或与副作用发生有关的一类生物学效应。其中能促进机体能量代谢、物质代谢的中药多具有热(或温)性，抑制机体能量代谢、物质代谢的中药多具有寒(或凉)性。中药药性(气)可以通过宏观的正常或寒热动物模型实验，以及系统生物学等方法予以评价归属[3-4]。在这一假说的指导下，本实验基于热证模型归属桑白皮性味拆分组分的寒热药性。

桑白皮为桑科植物桑MorusCortexL.的干燥根皮[5],前期研究将桑白皮拆分为成分互不交叉的黄酮、苯骈呋喃、二苯乙烯、多糖、脂肪油组分[6-7]。为验证《黄帝内经》中用药原则“热者寒之”的科学性及桑白皮性味拆分组分的寒凉药性，本实验采用优甲乐建立热证模型[8]，给药15 d后检查各组大鼠体质量、肛温、自主活动次数及物质能量代谢相关酶的表达，以期更好地阐释桑白皮各性味拆分组分的药性。

1 材料

1.1 实验动物

雄性SPF级SD大鼠80只，体质量(180～200)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(许可证SCXK(京)2012-0001)。

1.2 药物

优甲乐(左甲状腺素钠片，MerkSerono，生产批号210128)。桑白皮性味拆分组分制备：桑白皮水煎液浓缩后，上DiaionHP-20柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脱，水洗脱液经过醇沉、干燥得到多糖组分，提取率4.4%。其他3个洗脱液经浓缩、干燥分别得到黄酮、苯骈呋喃和二苯乙烯组分，提取率分别为5.8%、0.31%、0.25%。脂肪油组分的提取方法：精密称取10 g干燥至恒重的桑白皮药材粉末(过60目筛)于滤纸筒内，置索氏提取器中，加入100 ml石油醚(60～90 ℃)回流提取6 h，提取液放冷至室温过滤，回收滤液，低温挥去溶剂，100 ℃干燥1 h后冷却，精密称定，经计算桑白皮得油率3.10%。

1.3 试剂与仪器

GCK(glucokinase葡萄糖激酶)、PFK-1(phosphofructokinase-1果糖磷酸激酶)、PGK(phosphoglycerate kinase磷酸甘油酸激酶)、PK(pyruvate kinase丙酮酸激酶)、PDH(pyruvate dehydrogenase丙酮酸脱氢酶)、acetyl-CoA(acetyl coenzyme A乙酰辅酶A)、CS(citrate synthase柠檬酸合酶)、ICD(isocitrate dehydrogenase异柠檬酸脱氢酶)、α-KGDHC(α-ketoglutarate dehydrogenaseα-酮戊二酸脱氢酶)、FUM(fumarase延胡索酸酶)、PYGL(glycogen phosphorylase糖原磷酸化酶)、GSK-3(glycogen synthase kinase糖原合成酶激酶-3)、ATGL(adipose triglyceride lipase脂肪甘油三酯脂酶)及能量代谢相关酶CCR(cytochrome C reductase细胞色素C还原酶)、COX(cytochrome C oxidase细胞色素C氧化酶)、ATPs(ATP synthaseATP合酶)、ADK(adenylate kinase腺苷酸激酶)、Na+-K+ATP酶、ATP、ADP、NAD+、NADH、NAD+/NADH含量检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司，批号20141203 A)，其他各种化学试剂均为市售分析纯(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)。

YLS-IB多功能大鼠自主活动记录仪(济南益延科技发展有限公司)；医用电子体温计(东阿阿胶阿华医疗器械有限公司)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo，USA)；5810R高速冷冻离心机(Eppendorf，Germany)；SK-1快速混匀器(常州国宇仪器制造有限公司)；移液器(Gilson，France)；BT25S十万分之一精密分析天平(Sartorius，Germany)；DZF-6050B真空干燥箱(北京恒泰丰科试验设备有限公司)；BCD-206TAS低温冰箱(海尔公司)；常规手术器械。

2 方法

2.1 动物的分组及给药

动物适应性喂养1周后，随机分为NC组(Normal Control group正常对照组)、M组(Model group热证模型组)、桑白皮水煎液组(MC)、黄酮组分组(Fla)、苯骈呋喃组分组(Ben)、二苯乙烯组分组(Oli)、多糖组分组(Pol)、脂肪油组分组(FO)。热证模型每日上午9点灌胃优甲乐120 μg/kg，NC组灌胃生理盐水，每日下午灌胃目的中药，NC组、M组给予生理盐水，MC组给予2.8 g/kg桑白皮水煎液，Fla组给予0.1624 g/kg黄酮组分，Ben组给予0.00868 g/kg苯骈呋喃组分，Oli组给予0.007 g/kg二苯乙烯组分，Pol组给予0.1232 g/kg多糖组分，FO给予0.0868 g/kg脂肪油组分，连续给药15 d。15 d后取大鼠肝脏、心脏迅速冻存于液氮中后，转移至-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 给药期间各组大鼠体质量、肛温、自主活动次数的记录

记录给药前及给药期间各组大鼠体质量及肛温的变化，同时记录给药第15天各组大鼠5 min内的自主活动次数。

2.3 物质能量代谢相关指标的检测

ELISA法检测各组大鼠肝脏中GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL、CCR、COX、ATPs、ADK、ATP、ADP、NAD+、NADH、NAD+/NADH的水平以及各组大鼠心脏中Na+-K+ATP酶的水平。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 桑白皮性味拆分组分对热证大鼠体质量、肛温、自主活动的影响

表1示，与NC组比较，M组大鼠体质量极显著降低(P<0.01)，桑白皮水煎液及各性味拆分组分组大鼠体质量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。与NC组比较，M组大鼠肛温、自主活动极显著升高(P<0.01)，与M组比较，桑白皮水煎液及各性味拆分组分组大鼠肛温、自主活动极显著降低(P<0.01)。

3.2 桑白皮性味拆分组分对热证大鼠物质代谢相关指标的影响

表2、3示，与NC组比较，M组GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL的表达显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)；与M组比较，桑白皮水煎液及各性味拆分组分组GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL的表达显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。

表1 桑白皮性味拆分组分对热证大鼠体质量、肛温、自主活动的影响

注：与NC组比较：**P<0.01；与M组比较：#P<0.05，##P<0.01

3.3 桑白皮性味拆分组分对热证大鼠能量代谢相关指标的影响

表4、5示，与NC相比，M组CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶、ATP、NADH的表达显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)，ADP、NAD+、NAD+/NADH的表达显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)；与M组比较，桑白皮各给药组CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶的表达显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)，ADP、NAD+、NAD+/NADH的表达显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。

表2 桑白皮水煎液及各性味拆分组分对热证大鼠营养物质氧化成乙酰辅酶A阶段相关酶的影响

注：与NC组比较：*P<0.05，**P<0.01；与M组比较：#P<0.05，##P<0.01

表3 桑白皮性味拆分组分对热证大鼠三羧酸循环阶段相关酶的影响

注：与NC组比较:*P<0.05，**P<0.01；与M组比较:#P<0.05，##P<0.01

表4 桑白皮性味拆分组分对热证大鼠能量代谢相关酶的影响

注：与NC组比较：**P<0.01；与M组比较:#P<0.05，##P<0.01

表5 桑白皮性味拆分组分对热证大鼠能量代谢相关物质含量的影响

注：与NC组比较：**P<0.01；与M组比较:#P<0.05，##P<0.01

4 讨论

中医诊断的寒热之证与机体的物质能量代谢密不可分，而中药的寒热药性可能会通过影响机体物质能量代谢的某些环节，来调节机体的寒热之证。吴桂琴、徐珊等[9-11]发现，寒性药龙胆草、黄芩、生黄柏能不同程度地抑制热证大鼠能量代谢。能量代谢非常复杂，包括氧化磷酸化过程中的许多酶和因子，而这些酶和因子起着调控作用[12]。本实验从物质能量代谢的角度出发，探讨桑白皮性味拆分组分对热证模型物质能量代谢的影响，以此归属桑白皮各性味拆分组分的寒热药性。

首先分析基础体征指标，与正常组比较，热证模型组大鼠的体质量显著降低，肛温及自主活动显著升高，这符合临床热证的病理表现。与模型组比较，桑白皮各性味拆分组分组大鼠体质量增加，肛温降低，自主活动减少，说明大鼠热证病证有所改善，推测桑白皮各性味拆分组分的药性可能为寒凉。

在生理状态下，体内物质能量代谢处于动态平衡，研究表明机体所需要的能量主要是通过生物氧化提供。根据三大营养物质氧化分解、释放能量的特点，可将生物氧化分为三个阶段：第一阶段，三大营养物质经过各自的代谢途径生成乙酰辅酶A。这个阶段包括葡萄糖有氧氧化及丙酮酸氧化脱羧生成acetyl-CoA过程，这个过程中GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH等酶发挥着重要作用。实验结果显示，热证模型大鼠肝脏中GCK、PFK-1、PK、PGK、PDH、acetyl-CoA的表达显著增加，而给药桑白皮性味拆分组分后均能够降低其酶的表达，与桑白皮水煎液的结果类似，说明桑白皮各性味拆分组分能够抑制热证模型大鼠体内的物质代谢。这可能与桑白皮各性味拆分组分的寒凉药性有关。

第二阶段，acetyl-CoA进入三羧酸循环，脱羧生成CO2，脱氢生成NADH+H+和FADH2，此阶段中有CS、ICD、α-KGDHC及FUM酶的参与，在模型组大鼠体内CS、ICD、α-KGDHC及FUM的水平均增加，而给药桑白皮性味拆分组分后均能够下调其酶的表达，与桑白皮水煎液类似，这说明桑白皮各性味拆分组分能够改善三羧酸循环过程的快速代谢状况。第三阶段，NADH+H+或FADH2携带的2H通过线粒体内膜上的呼吸链依次传递，最终与氧结合生成水，并释放大量的能量。在此阶段中，CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶为关键限速酶。结果显示，热证模型组大鼠CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶的表达增加，而给药桑白皮性味拆分组分后各酶的表达均下降，与桑白皮水煎液效果相似，进一步说明桑白皮各性味拆分组分的药性可能为寒凉。

机体在应激状态下，还可以通过肝糖原的分解以及脂肪动员提供能量，在这个过程中PYGL和GSK-3在糖原的分解和合成中发挥着重要作用。PYGL是催化糖原分解生成葡萄糖的关键别构酶，GSK-3可以间接抑制糖原的合成，ATGL在脂肪动员中发挥着重要作用。分析实验结果，与热证模型组比较，热证模型大鼠体内PYGL、GSK-3和ATGL的水平均升高，而给药桑白皮性味拆分组分后PYGL、GSK-3和ATGL的水平均降低，与桑白皮水煎液作用一致，说明桑白皮各性味拆分组分能够抑制糖原分解及脂肪动员进程，这与其药性为“寒凉”有关。

从物质代谢和能量代谢的角度分析，热证模型组大鼠的肛温、自主活动次数、物质能量代谢相关酶GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、ATGL、ATP、CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶、NAD+、NAD+/NADH的表达及含量极显著升高，ADP、NADH的表达极显著降低，表明热证模型大鼠的物质能量代谢处于高水平亢奋状态，而给药桑白皮各性味拆分组分后能够显著抑制热证模型物质能量代谢的高水平亢奋状态，与桑白皮水煎液效果类似。这与本课题“促进机体能量、物质代谢的中药具有热(或温)性，抑制机体能量、物质代谢的中药具有寒(或凉)性”这一假说相符。同时也与中医临床“热者寒之”的治则吻合，因此说明桑白皮各性味拆分组分的药性为寒(凉)性。