葡萄黑痘菌侵染应答中ERF转录因子的基因表达分析

高嘉沛 林仕钰 张景怡

（西北农林科技大学园艺学院，陕西咸阳 712100）

我国主要栽种的葡萄品种为欧洲葡萄，其品质优良，但易染病且多为真菌病害[1]。葡萄黑痘病在世界葡萄产区均有发生，尤以多雨潮湿地区受害严重[1]。我国的葡萄主栽品种易感黑痘病[2]，每年由于黑痘病使葡萄产量减产约18.5%[3]，且品质大幅下降。因此，如何提高葡萄自身抗病性是现阶段葡萄抗病育种工作的一大难点。本研究以感病的欧洲葡萄无核白与抗病的毛葡萄商-24为研究材料，通过半定量RT-PCR与荧光实时定量PCR对ERF家族进行了其在葡萄受黑痘病侵染后应答过程中的基因表达分析。

1 实验方法

本研究以Li Zhi等[4]的方法对葡萄黑痘菌进行分离并培养，取无核白与商-24幼嫩叶片为实验材料，将黑痘菌活化1 d后配置浓度均一的孢子悬浮液，均匀喷洒于材料，在23 ℃的环境中进行保湿培养，并在接种后的12、24、48、72 h收集样品及空白对照。用天根植物RNA提取试剂盒提取mRNA，检验纯度后，用TaKaRa试剂盒进行反转录。根据课题组前期实验筛选ERF家族基因，用PrimerPremier5设计引物并检验其特异性。以相应cDNA为模板进行RTPCR（体系为20 μL），产物用1%琼脂凝胶电泳、EB染色进行半定量分析。定量分析主要操作与半定量分析相同，但在体系中加入荧光染料以进行实时定量PCR。

2 实验结果

2.1 半定量分析结果本实验首先利用半定量RT-PCR技术，发现接种黑痘菌后无核白中VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF24、VvERF33、VvERF35和 VvERF47的 表达与对照相比出现差异；商-24中VvERF02、VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF33、VvERF35、VvERF47、VvERF57和VvERF64出现差异。其中，有6个基因（VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF33、VvERF35和VvERF47） 在两个品种中均有强烈的响应。

2.2 定量分析结果对上述6个基因进行定量分析，显著表现出上调趋势的基因定量分析结果如图1所示。由图可以看出，VvERF12在处理下显著上调，VvERF33除了无核白的24 h样品外显著上调，考虑可能存在一定的实验误差。

图1 葡萄ERF基因在黑痘菌感染处理下的定量分析

3 实验结论

本实验对葡萄中的ERF家族基因进行了鉴定，半定量分析发现对黑痘菌侵染应答中表现出显著响应的有VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF33、VvERF35和VvERF47； 定量分析发现其中显著上调的基因是VvERF12和VvERF33。