影响动物布氏杆菌病试管凝集试验的因素分析

章天霞

摘要    本文分析了动物布氏杆菌病试管凝集试验中的影响因素，具体包括血清样品的送检要求、稀释液的正确配制、试剂的正确保存与使用、试管准备、样品和稀释比例的确定、结果判定等方面内容，并阐述了注意事项，以期为布氏杆菌病的防治提供参考。

关键词    布氏杆菌病;试管凝集反应;影响因素

中图分类号    S855.12;R516.7        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）08-0230-01                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    This article analyzed the influencing factors in experiment for test tube agglutination of brucellosis in animals，including the requirem-ents for the submission of serum samples，the correct preparation of dilutions，the correct storage and use of reagents，the preparation of test tubes，the determination of sample and dilution ratios，results judgment，and other aspects.The precautions were elaborated，in order to provide references for the prevention and treatment of brucellosis in animals.

Key words    brucellosis;test tube agglutination reaction;influencing factor

试管凝集反应（SAT）是诊断动物布氏杆菌病的常规方法之一，由于其操作简便，具有较高的特异性和敏感性，能够在很大程度上检出病畜，因而是基层兽医实验室常用的一种检测方法。但在实践中由于各种因素的影响，会导致结果不准确、有偏差。现根据本人多年在基层兽医实验室的工作经验，进行剖析，以供参考。

1    试管凝集试验反应原理

颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。

2    影响因素及处理措施

2.1    被检血清

一是被检血清必须新鲜，无明显蛋白质凝集物，无溶血，无腐败[1]。二是防止血清冻结和受热，影响凝集效价。若3 d内不能送到实验室，应冷藏保存，或按9份血清加入1份1.5%石碳酸生理盐水的比例进行防腐。

2.2    稀释液的正确配制

石碳酸用60 ℃水浴加热至熔化，用量程为1 mL的移液器小心吸取0.5 mL加入到99.5 mL的生理盐水中，溶解定容至100 mL。将配制的溶液放置于高压灭菌器内，于121 ℃、103.4 kPa、30 min条件下高压灭菌。

2.3    试剂的正确保存与使用

所有试验试剂均需保存在2～8 ℃冰箱内;试验前观察试剂是否在有效期内;观察试剂瓶口是否完好无损;同时在试验前将凝集抗原恢复至室温。

标准阴阳血清均为冻干品，需按要求加入规定量的稀释液充分溶解混匀备用。以實验室购入哈药集团的为例，阳性血清需要加入1 mL稀释液，阴性血清需要加入2 mL稀释液。

抗原使用前要充分摇匀或使用大量程移液器充分吹吸混匀。试验前依照说明书粗略计算所需的1∶20抗原用量，然后将抗原用0.5%石碳酸生理盐水作20倍稀释[2]。

2.4    试管准备

将脏试管放入加有洗涤剂的温水中浸泡30 min，用试管刷刷洗干净，再用自来水冲洗，最后用去离子水冲淋。沥干水分，放于干燥箱内，在160 ℃条件下干燥3 h。

2.5    样品和稀释比例的确定

试验前先要了解样品的种类，然后再采用不同的稀释比例。猪、羊的稀释方法相同，牛、马、骆驼的稀释递度相同。加入0.5 mL 20倍稀释抗原后，最终羊、猪的血清稀释递度为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，而牛、马、骆驼的稀释递度为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400[3]。

2.6    比浊管的正确配制

每次试验都需配制比浊管，作为凝集反应程度的判定依据。具体如表1所示。

2.7    结果判定

2.7.1    对照组情况分析。每次试验均需设立阴阳对照及抗原对照，判定结果的第一步就是判断阴阳对照组是否成立，抗原是否发生自凝现象。

2.7.2     定性分析。如表1所示，将每份样品的第2管与比浊管的第3管相比较，如果较比浊管第3管上层液清亮则为阳性;反之，则为阴性。

2.7.3    粗略定量分析。如表1所示，将每个样品的4个稀释度分别与比浊管第3管比较。以猪、羊为例，若样品第4管较比浊管第3管清亮，则凝集效价记为：>200;若样品第4管与比浊管第3管差不多，凝集效价记为：200;若样品第4管较比浊管第3管混浊，而第3管较比浊管第3管清亮（或差不多），则凝集效价记为：100;若样品第3管较比浊管第3管混浊，而第2管较比浊管第3管清亮（或差不多），则凝集效价记为：50;若样品第2管较比浊管第3管混浊，而第1管较比浊管第3管清亮（或差不多），则凝集效价记为：25;若样品第1管较比浊管第3管混浊，则记为：<25。

3    注意事项

一是移液器的正确使用。移液器的最佳量程范围是最大量程的35%～100%。一般情况下，移液器具有2个档位，第1档为正确量程;第2档容量远超预定量程，如果操作失误会造成加样体积过大，导致结果严重偏差。移液器滴头要安装牢固，防止漏气，吸量液体时要将滴头伸入液面以下适当位置，保证达到所需的移液量，同时让吸头外壁尽量少接触液体。二是加样稀释时要充分混匀，保证稀释递度的准确性。1∶20 配制抗原使用之前及滴加后也要充分摇匀，使血清中的抗体与抗原反应充分[4-5]。三是严格按操作规程设定反应时间与温度——37～40 ℃，24 h。四是试验完成后，将试管封膜放入培养箱，确保试管中反应体系稳定。五是在加样过程中可能会出现漏加样或误加样。六是判定样品凝集效价时，人为因素影响比较大，可以同时参考虎红平板凝集试验结果[6-8]。

4    参考文献

[1] 国家质量监督检验检疫总局.动物布鲁氏菌病诊断技术：GB/T18646-2002[S].北京：中国标准出版社，2002.

[2] 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则》应用要求：CNAS-CL52：2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[3] 中国合格评定国家认可委员会.检测和校准实验室能力认可准则：CNAS-CL01：2006[S].北京：中国标准出版社，2006.

[4] 贾泽颖，刘邓，郭安娜，等.布鲁氏菌病多种检测方法的比较[C]//首届中国奶业大会论文集（上冊）.北京：中国奶业协会，2010.

[5] 郑源强，吴岩，毕力夫.布鲁氏菌病检测、防控措施与疫苗研究进展[C]//2011新型疫苗与抗体创制关键技术及质量控制研讨会论文集.北京：全国医药技术市场协会，2011.

[6] 师志海，王文佳，兰亚莉.布氏杆菌检测方法的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2011（15）：44-46.

[7] 刘磊，刘晶芝，赵宝华.布氏杆菌病的检测与防治[J].安徽农业科学，2007（20）：6139-6141.

[8] 廖雅丽，张哲林，任彩云，等.布氏杆菌病研究进展[J].内蒙古医科大学学报，2015，37（增刊1）：73-77.