表面增强拉曼光谱法快速测定娃娃菜中啶虫脒残留

蓝勇波，江培淳，林长虹，袁福定，古丽君，郑彦婕*

深圳市计量质量检测研究院（深圳 518000）

啶虫脒是一种新型烟碱类杀虫剂，广泛用于农产品的害虫防治，同时也对动物的神经系统和生殖系统具有潜在毒性，对人类健康构成威胁[1-2]。所以，进行蔬菜中啶虫脒残留量的测定具有重要意义。目前主要的检测方法是基于色谱，包括高效液相色谱法[3]、气相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用法[5]、气相色谱-质谱联用法[6]等。这些方法依赖大型仪器，样品前处理时间长。因此，有必要建立一种简单、快速、准确的方法，进行啶虫脒的检测。表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）具有仪器便携、检测速度快、灵敏度高、能提供分子指纹信息等特点，适合现场快速检测。现已逐步用于食品中非法添加剂、农兽药残留、肉类品质以及保健品中非法添加物等的快速检测[7-9]。在实际应用中，由于SERS的增强基底纳米金和纳米银受样品基体影响较大，适当的样品前处理方法可以有效提高SERS定性定量的准确性。覃文霞等[10]建立了一种新型溶剂萃取法提取糕点及白酒中的糖精钠，并采用稀硝酸作为凝聚剂使纳米金与目标物分子紧密结合后检测，获得较强的SERS信号。林翔等[11]使用三氯乙酸沉淀牛奶中的蛋白质，同时促进纳米银的聚集，增强信号，简化试验步骤，提高检测的灵敏度。

试验使用纳米金作为SERS增强基底，对娃娃菜样品前处理条件以及SERS检测条件进行优化，在优化条件下建立啶虫脒的定量方法，为娃娃菜中啶虫脒的快速测定提供试验依据，也为开发适合SERS检测的蔬菜前处理方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

娃娃菜，购自深圳市某大型生鲜超市；98.1%啶虫脒标准品，购自Dr. Ehrenstorfer GmbH；99.0%无水乙酸钠、纯活性炭，均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；99.5%氯化钠，分析纯，购自广州化学试剂厂；98.0%无水硫酸镁，分析纯，购自永华化学科技（江苏）有限公司；中性氧化铝（100～200目），购自国药集团化学试剂有限公司；石墨化碳黑（60～80目），购自天津市光复精细化工研究所；N-丙基乙二胺（PSA），购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；十八烷基硅烷键合硅胶（C18），购自上海博势生物科技有限公司；乙腈，色谱纯，购自深圳市晶园玻璃仪器有限公司；纳米金（OTR202），购自苏州欧普图斯光学纳米科技有限公司；拉曼测试管，购自赛默飞世尔科技有限公司。

RamTracer-200-cm激光拉曼光谱仪，苏州欧普图斯光学纳米科技有限公司；JA1203B电子天平，上海越平科学仪器有限公司；IKA VORTEX3振荡器，艾卡（广州）仪器设备有限公司（IKA中国）；H1850离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 样品前处理

称取2.0 g均质后的娃娃菜样品于离心管中，向其中加入4 mL乙腈和2.0 g无水硫酸镁，振动5 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清液于含有60 mg PSA和60 mg C18的离心管中，振荡2 min，以4 000 r/min离心3 min，上清液为待测液。

1.3 SERS检测

激光光源功率200 mW，激发波长785 nm，积分时间10 s，积分3次，取平均值。将600 μL纳米金、20 μL待测液依次加入拉曼测试瓶中，混合2 min后进行光谱检测。

2 结果与分析

2.1 光谱定性

与未经过前处理的娃娃菜加标提取液SERS谱图（图1-b）相比，经过前处理的娃娃菜加标提取液SERS谱图（图1-a）出现了多个明显的啶虫脒特征峰，且没有1 520 cm-1处的杂峰。结果说明该样品前处理方法能有效地去除娃娃菜基质干扰，增强啶虫脒分子的SERS特征峰信号。

由图1（a）可以看出，628，827，1 041，1 107和1 493 cm-1处出现特征峰，分别归属于C—Cl基团伸缩振动、苯环的呼吸振动、苯环的伸缩振动、N—C＝N基团的伸缩振动以及苯环的伸缩振动[12]。其中628 cm-1处的特征峰信号较强，且附近无干扰信号。因此，选择628 cm-1处的特征峰作为检测娃娃菜中啶虫脒农药残留的定性分析峰。

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 萃取盐的种类及用量

萃取盐的主要作用是加速目标分子与萃取相的传质过程，使目标分子萃取进有机层，与水相杂质分离。在SERS检测中，某些萃取盐还可以起到调节待测液酸碱性、改变纳米金增强基底聚集状态从而改变SERS信号的作用。固定PSA、C18的用量和SERS检测条件，考察氯化钠固体、无水醋酸钠、无水硫酸镁不同加入量对SERS信号的影响，结果如图2所示。当无水硫酸镁的用量为2.0 g时，加标提取液的SERS信号最强。无水硫酸镁溶于水，呈弱酸性，提取溶剂乙腈中含有少量水，因此待测液也呈弱酸性。纳米金与待测液混合之后发生团聚，SERS信号增强。这是因为纳米金粒子表面电磁场显著增强，粒子间产生强的表面等离激元耦合，导致其中的SERS信号增强[13]。无水硫酸镁用量过多时，纳米金团聚成大颗粒沉淀下来，待测液中起增强作用的纳米金数量变少，SERS信号大幅度下降。氯化钠溶液为中性，对SERS信号增强效果较弱。加入少量无水醋酸钠时，有增强效果，随着用量增大，SERS信号随之减弱。醋酸钠水溶液为碱性，啶虫脒在碱性环境下不稳定。因此，根据试验结果，选择无水硫酸镁作为萃取盐，用量为2.0 g。

图1 娃娃菜啶虫脒加标提取液的SERS谱图

图2 萃取盐种类和用量对SERS信号的影响

2.2.2 净化剂的种类及用量

PSA含有强极性的氨基基团，易与脂肪酸、糖类、醇等分子中的羟基形成共价键将其吸附[14]。中性氧化铝也是一类强极性的吸附填料，通常用于去除芳香族和脂肪族的化合物[15]。固定无水硫酸镁、C18的用量和SERS检测条件，考察PSA和中性氧化铝这两种强极性净化剂不同加入量对SERS信号的影响。由图3（A）可知，当PSA用量为60 mg时，待测液有最强的SERS响应。

C18含有十八烷基，易于吸附非极性或极性小的分子，如脂肪和蜡质等[16]。GCB表面为疏水性，可以吸附非极性和弱极性化合物，如色素和甾醇类[17]。固定无水硫酸镁、PSA的用量和SERS检测条件，考察C18和GCB这两种弱极性净化剂不同加入量对SERS信号的影响。由图3（B）可知，当C18用量为60 mg时，待测液有最强的SERS响应。因此，采用60 mg PSA和60 mg C18用于娃娃菜中啶虫脒的提取。

图3 净化剂种类和用量对SERS信号的影响

2.3 SERS检测条件优化

2.3.1 待测液用量

固定前处理条件、纳米金用量、纳米金和待测液混合时间，考察待测液用量对SERS信号的影响。如图4所示，SERS信号随着待测液用量的增加，呈现先增加后减小的趋势，当用量为20 μL时，有最强的SERS信号。当待测液用量小于20 μL时，SERS信号低。这可能是啶虫脒分子数目较少，SERS信号较弱。当待测液用量大于20 μL时，因为盐溶液过多导致纳米金形成沉淀，待测液中纳米金数目减少，导致SERS信号强度减小[18]。因此，选择20 μL作为SERS检测时最优的待测液用量。

2.3.2 纳米金用量

固定前处理条件、待测液用量、纳米金和待测液混合时间，考察纳米金用量对SERS信号的影响。从图5可以看出，啶虫脒加标提取液在628 cm-1处的信号强度随纳米金用量的增加，呈现先增加后减小的趋势。当纳米金加入量为600 μL时，有最强的SERS响应。纳米金用量过小，部分待测物分子没有被增强；用量过大，纳米金稀释待测物的作用大于增强作用，SERS信号降低。因此，选择600 μL作为SERS检测时最优的纳米金用量。

图4 待测液用量对SERS信号的影响

图5 纳米金用量对SERS信号的影响

2.3.3 待测液与纳米金混合时间

纳米金溶胶与待测液混合后的聚集状态会随着时间变化，导致SERS相应的变化。固定前处理条件、待测液用量、纳米金用量，考察纳米金和待测液混合不同时间后SERS信号的变化。如图6所示，SERS信号强度随混合时间的增加，呈现先增加后减小的趋势。当混合120 s后，有最强的SERS响应。这是因为混合时间的长短影响待测液中啶虫脒分子在纳米金表面的吸附量和两者的聚集程度，进而影响到SERS特征峰强度[19]。因此，将纳米金溶胶和待测液混合120 s后进行SERS检测。

图6 混合时间对SERS信号的影响

2.4 娃娃菜中啶虫脒的定量分析

在优化条件下以628 cm-1处特征峰峰面积（Y）对应娃娃菜提取液浓度（X，mg/kg）绘制标准曲线，结果如图7所示。该方法在1.0～60 mg/kg浓度范围内具有良好的线性关系，方法的工作曲线为Y=759.15X+ 11 095（R2=0.991 1），能检出的最低浓度为0.5 mg/kg。方法的灵敏度满足GB 2763—2016《食品国家安全标准食品中农药最大残留限量》白菜类中啶虫脒限量的检测要求（1 mg/kg）。

应用优化的前处理方法、SERS检测条件和工作曲线，对啶虫脒加标浓度为1，2和5 mg/kg的娃娃菜进行回收率试验，结果如表1所示。加标回收率的范围为81.0%～110.0%，相对标准偏差RSD为3.3%～8.5%（n=6）。结果表明所建立的方法准确度和精密度可靠，可满足白菜类中啶虫脒的快速检测要求。

图7 不同浓度加标的SERS谱图（A）和标准曲线（B）

表1 娃娃菜样品加标回收试验结果

3 结论

试验建立了一种娃娃菜中啶虫脒农药残留的表面增强拉曼光谱分析法。通过试验，优化了前处理条件和SERS检测条件。在最佳检测条件下，啶虫脒的浓度与628 cm-1处的拉曼特征峰面积在1.0～60 mg/kg范围内具有良好的线性关系，最低检测浓度可达0.5 mg/kg，回收率范围为81.0%～110.0%，相对标准偏差在3.3%～8.5%之间。该方法具有操作简便、快速准确等优点，适用于娃娃菜中啶虫脒的快速检测，同时为开发适合SERS检测的蔬菜前处理方法和检测方法提供参考依据。