中华绿螂抗氧化肽的提取及其抗氧化性

李翠芬，吕建秋，孔美兰

华南农业大学食品学院（广州 510642）

作为对生命体特殊生理功能的营养物质，活性肽对机体生命活动具有重要的作用，由于其可被人体肠道直接吸收，比氨基酸更易进入血液，成为20世纪90年代后期的开发热点[1]。在生物活性肽和功能性食品的研究中，通常会将生物活性肽作为食品及保健品原料或添加原料，其用途广、前景佳、市场潜力大。抗氧化活性肽从属于生物活性肽[2]。生物体内的具有抗氧化活性的物质许多都属于蛋白质类，蛋白质优良的乳化特性，使其能在油水界面起桥梁作用，在清除过量自由基和抑制膜脂质过氧化方面具有重要的研究意义[3]。随着生物学的迅猛发展，发现由于结构特点，介于蛋白质和氨基酸间的肽类与氨基酸、大分子蛋白质等其他生物分子相比，其食用安全性、活性、多样性更加突出。其抗氧化性比蛋白质和氨基酸更为显著[4]。

抗氧化肽是热门的研究方向，抗氧化肽对于抑制、延缓脂质氧化，保护人体组织器官免受自由基侵害有特定作用[4]。食物蛋白通过水解作用得到的抗氧化肽具有天然性、高安全性、强抗氧化性和易吸收性等特点[4-5]。抗氧化肽的作用机理是直接作用在自由基，或者间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生氧化反应进一步发生[5]。

中华绿螂是一种低脂肪高蛋白食品，是粤东地区盛产的水产品，可作为制取抗氧化肽的优质原料。由于中华绿螂加工技术水平和回收手段落后，造成大量水溶性蛋白流失，且对废水处理带来新的难题[6]。试验以中华绿螂作为原料，利用响应面法和超滤法，对中华绿螂中抗氧化肽的木瓜蛋白酶水解提取工艺条件进行优化，以减少废水处理的负担，并将没有开发利用的蛋白资源转化，成为高附加值的健康物质。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

1.1.1 材料

中华绿螂（2016年7月购于潮州市枫春市场，所用部位为去壳后的肉，经热风干燥和粉粹过筛后密封冷冻保存）。

1.1.2 试剂

木瓜蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析纯，美国Sigma公司）；95%乙醇（分析纯，东莞市正源化工有限公司）；盐酸（分析纯，佛山市伟丰贸易有限公司）；氢氧化钠（分析纯，德州市富凯化工有限责任公司）。

1.2 仪器与设备

电子天平（BSA124S，赛多利斯科学仪器有限公司）；酸度计（PB-10，赛多利斯科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（HWS-24，上海一恒科学仪器有限公司）；高速台式离心机（H1650，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；可见分光光度计（WFJ7200，尤尼柯仪器有限公司）；数控超声波清洗器（KQ-500DV，昆山市超声仪器有限公司）；切向流超滤系统（BIOQ-MV1000，汇和堂生物工程设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

原料的预处理→中华绿螂悬浮液→调值→设计不同温度、pH、加酶量和水解时间的试验进行酶解→95℃，灭酶→离心→上清液为含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液→测定自由基清除率

最优工艺条件下→重复上述步骤制备含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液→超滤纯化→测定自由基清除率→确定最佳超滤膜孔径

1.3.2 试验步骤

1.3.2.1 原料预处理

将中华绿螂浸泡吐沙、冲洗、热烫、去壳取肉、65℃下烘干、高速粉碎、50目过筛，得到中华绿螂粉即为试验原料，真空包装并冷冻储藏备用。

1.3.2.2 制备含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液

准确称取1.00 g干燥的中华绿螂粉，置于烧杯中，加入30 mL新鲜制备的蒸馏水，搅拌使其形成悬浊液，用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L的HCl溶液调节pH至酸度计显示出所需值为止，待恒温水浴锅升至所需温度，一边搅拌一边往烧杯加入一定量木瓜蛋白酶，用保鲜膜封住杯口避免水分的挥发，把烧杯放置进去，到达所需时间即反应完毕，将烧杯拿出并置于95℃水浴中灭酶10 min，灭酶结束后用流水冲淋杯壁使之冷却至常温，离心（4 000 r/min、15 min）取上清液，即得不同浓度水解液[7]。

1.3.2.3 酶解物DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基常用来研究酚类抗氧化剂构效关系，是一种合成的有机自由基。DPPH乙醇溶液呈紫色，在波长517 nm处有一强吸收，但是自由基清除剂与其单电子配对而使其吸收减弱，其褪色程度与接受的电子数呈定量关系，因而可用分光光度计法进行定量分析。

称取0.025 6 g DPPH试剂，用乙醇50%溶解，定容转入100 mL容量瓶中，将DPPH储备液摇匀，质量浓度为0.025 6 g/100 mL，置于冰箱冷冻备用，在使用之前将50%乙醇稀释成质量浓度0.002 5 g/100 mL。将DPPH溶液在正常室温的情况下放置10 min后，在反应容器中加入2 mL 0.002 5 g/100 mL的DPPH乙醇溶液，加入2 mL不同浓度的中华绿螂肉蛋白质水解液，混合摇匀，在正常的室温情况下避光反应30 min，将50%乙醇归零，测定波长517 nm处吸光度（A0）。测定2 mL DPPH溶液与2 mL 50%乙醇溶液在波长517 nm处吸光度（Ai），测定2 mL样品待测液与2 mL 50%乙醇溶液在波长517 nm处吸光度（Aj）。在同一条件下重复3次，计算求出自由基清除率，取平均值[8]。

2 结果与讨论

2.1 响应面法优化中华绿螂抗氧化肽提取工艺

2.1.1 单因素试验指标

分别在固定的酶与底物浓度比值（[E]/[S]）、酶解温度、酶解pH和酶解时间条件下，考察酶与底物浓度的比值（[E]/[S]）、酶解温度、酶解pH和酶解时间对中华绿螂含抗氧化肽的可溶性蛋白的自由基清除率的影响。

根据单因素条件试验，初步选定酶与底物浓度比值（[E]/[S]）5%、酶解温度55℃、酶解pH 5.0和酶解时间2.5 h为最佳提取条件，采用响应面法对酶解提取中华绿螂中抗氧化肽的工艺条件进行优化[9]。

2.1.2 响应面分析

在单因素试验结果基础上，以酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶与底物浓度的比值（C）和酶解pH（D）作为影响因素[9]，以DPPH自由基清除率（R）作为响应值，根据Box-Beknhen中心组合试验设计原理，设计四因素三水平响应面试验。试验进行29次，每个试验点重复做3次，结果取3次数据的平均值。采用随机化原则以减少随机误差。试验安排及结果见表1和表2。

表1 中华绿螂抗氧化肽提取响应面试验设计因素水平

表2 中华绿螂抗氧化肽提取工艺优化响应面法试验设计及结果

2.1.3 模型的建立及其显著性检验

试验用酶解法处理中华绿螂以提取抗氧化肽，以自由基清除率为指标，采用响应面分析法优化最佳工艺条件，利用Design-Expert软件对表2数据进行二次多项式模型和多元线性模型拟合，得到最佳的数学模型。

从方差分析及相关系数考察模型可靠性。由表3可知，模型F=2.57＞F0.05(14,14)=2.48，p＜0.05，证明试验所用二次多项模型具有显著性。在总的作用因素下，B项的影响显著，而方程的交互项p＞0.05，表明其对中华绿螂抗氧化肽提取的影响不显著，各具体因子对响应值的影响不是简单的线性关系，各因子间交互作用影响不显著，可忽略。失拟项F=1.86，在α=0.05水平上不显著，说明该模型能很好地描述试验结果，可用该模型来分析和预测中华绿螂提取抗氧化肽的工艺结果[9]。

2.1.4 提取工艺的响应曲面分析与纯化

为更直观地表现2个因素对中华绿螂抗氧化肽含量的影响，可以令其他因素水平值为零，即是以酶与底物浓度的比值（[E]/[S]）、酶解温度、酶解pH和酶解时间4个因素中1个因素取零水平时，另3个因素对中华绿螂抗氧化肽自由基清除率得影响进行分析。图1～图6反映各因素交互作用对响应值的影响。

结果显示，B（酶解温度）对中华绿螂提取抗氧化肽的效果影响最为显著，表现为曲线较陡，随着A（酶解时间）、C（酶与底物浓度比值）、D（酶解pH）增加或减小，响应值变化较大；A（酶解时间）、C（酶与底物浓度比值）、D（酶解pH）对响应值影响较小，曲线较为平滑，其数值的增加或者减小，对响应值变化都较小[9]。

表3 回归方程各项的方差分析表

图1 酶解时间与酶解温度的响应曲面关系图

图2 酶解时间与酶用量的响应曲面关系图

图3 酶解时间与pH的响应关系图

图4 酶解温度与酶用量的响应关系图

图5 酶解温度与pH的响应关系图

考虑到实际操作的可行性，将提取抗氧化肽工艺条件修正为酶解时间3 h、酶解温度46.9℃、酶与底物浓度比值6%、酶解pH 4.11，在此条件下进行3次重复验证试验，中华绿螂抗氧化肽自由基清除率为97.93%，与理论值基本吻合，说明采用响应面法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有一定实用价值。

表4 中华绿螂抗氧化肽自由基清除率最优值及其最大得率的预测值表

2.2 超滤法纯化对其抗氧化性的影响

固定操作压力、操作温度及料液质量浓度等工艺参数来考察5个不同截留相对质量的超滤膜对可溶性蛋白酶解物的初步分离纯化效果[10]。

由表5可见，截留相对质量3 000～1 000 Da的超滤膜对于中华绿螂抗氧化肽自由基清除率的效果最好，为94.96%，说明抗氧化肽的相对分子量在3 000～1 000 Da，有利于抗氧化肽与大分子物质、溶剂的分离，有分离时间短，不发生相变，以及成本低等优点，且易于实现工业化生产。

表5 不同截留相对质量的超滤膜对中华绿螂抗氧化肽自由基清除率影响表

3 结论

图6 酶用量和pH的响应关系图

2.1.5 提取工艺的优化与验证

用Design Expert软件对试验参数进一步优化，可以得到最优条件：A（酶解时间）3.09 h（实际应用采用3 h）、B（酶解温度）46.9℃、C（酶与底物浓度比值）6%、D（酶解pH）4.11。此时中华绿螂抗氧化肽自由基清除率可达98.89%，可得到方程R1= 84.47-0.32A-9.68B+7.92AB-11.5B2。

木瓜蛋白酶水解中华绿螂制备抗氧化肽的最优工艺条件为：底物浓度6%、pH 4.11、酶解温度40℃、酶解时间3.09 h、超滤膜截留分子质量3 000～1 000 Da。在此条件下，中华绿螂抗氧化肽对DPPH自由基清除率为97.64%，超滤所得可溶性蛋白酶解物的抗氧化性为94.96%，所得回归模型显著（p＜0.05），与理论预测值基本吻合。由此看来，中华绿螂蛋白酶解物中存在清除自由基的活性肽，表现出较好抗氧化能力，为中华绿螂制取天然抗氧化肽提供理论依据。

4 展望

随着生活水平的提高，人们逐渐认识到人的衰老和许多疾病与体内物质氧化产生的自由基密切相关[10]。在人体新陈代谢过程中会不断产生各种自由基，并作为难以分解的代谢物残留在人体内。自由基是指含有一个或多个未配对电子的分子、原子、基团或离子，化学性质活泼，反应性极强，容易反应生成稳定分子[11]。

因此，把抗氧化肽作为抗氧化剂应用到食品、化妆品和医疗保健品等行业中，抗氧化肽可以做到营养、天然、安全、无毒、健康、保健的要求。

抗氧化剂被广泛应用于化妆品、食物，生产量最大的是化学抗氧化剂，但受到毒性作用的限制。由于水解反应制备的抗氧化肽毒性小，更天然，更安全，因此往往比化学合成抗氧化肽更受到青睐[12]。抗氧化性是近年来国内外学者对多肽生物活性研究中的一个热点，来源于食物蛋白的抗氧化肽，不但抗氧化性优良且安全性高，因而在保健食品及生物医药领域的应用前景十分可观[12]。

中华绿螂可溶性蛋白回收利用制备抗氧化肽可对废水处理发挥作用，减少资源浪费，也为抗氧化的制备在水产领域开拓思路。