高效液相色谱法检测辣条中喹诺酮类药物的方法

唐黎琼，马媛媛，彭英，赵波，邱会东*

1. 通标标准技术服务（上海）有限公司（上海 200233）；

2. 重庆科技学院化学化工学院（重庆 401331）；3. 上海进出口检验检疫局（上海 200135）

辣条作为国内许多青少年、儿童喜欢的零食之一，大多数辣条等麻辣类食品[1-5]因生产环境不卫生，可能会导致拉肚子等肠胃现象，而不法商家为防止此类现象出现，非法向辣条等麻辣食品中添加具有抗菌普广、副作用小、价格便宜等优点的喹诺酮类抗生素，这类药物不仅会残留在食品里，逐渐增加细菌的耐药性，还会通过食物进入人体，危害人体健康，损害消化系统、神经系统、免疫系统等。然而，休闲食品辣条中喹诺酮类药物的分析研究在国内还未见相关报道，试验选取常见的氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星3种喹诺酮类药物作为分析对象，建立一种液相色谱法检测辣条中喹诺酮类药物的分析方法，为国家相关职能监督管理部门更有效开展该类食品安全监控，并对国家监管部门制定相应检验方法标准提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（LC-20AD，日本岛津公司）；高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；旋涡混合器（美国Henry Troemner公司）；超声波提取仪（上海宁商超声仪器有限公司）；氮吹仪（上海安谱实验科技有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸和三乙胺（均为色谱纯试剂）；EDTA、柠檬酸、磷酸氢二钠、氨水、正己烷、乙酸乙酯（均为分析纯试剂）；氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星（均为标准品，源叶生物科技有限公司）。

辣条（重庆市售“长寿面”“面筋”“叫花鸡”“羊肉串”等4个不同辣条产品）。

1.2 试验方法

准确称取2 g辣条试样于15 mL离心管中，用移液管准确移取10 mL含1%乙酸的乙腈溶液于离心管中，涡旋振荡1 min，充分混合均匀后，放入超声提取仪中超声15 min，高速离心5 min，过滤上层清液。向残渣中加入5 mL含1%乙酸的乙腈溶液，重复操作，将2次上层清液用0.22 μm尼龙滤膜过滤至刻度试管中，放于40℃氮吹仪中吹至近干，加入2滴甲酸后，用甲醇定容到2 mL，滤液进行高效液相色谱检测，辣条类食品前处理及分析过程示意图如图1所示。

图1 辣条食品前处理及分析过程示意图

1.3 仪器测试条件

LC-20A高效液相色谱的色谱条件：岛津C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相A为0.1%磷酸水溶液（用三乙胺调pH至2.8），流动相B为甲醇；流速1 mL/min；柱温为室温；激发波长351 nm，发射波长465 nm；进样量10 μL；二元梯度洗脱。

2 结果与讨论

2.1 喹诺酮类药物荧光光谱

利用50 μg/mL喹诺酮类药物混合标准溶液在波长320～580 nm范围内进行最大发射波长（EM）的扫描，在波长252～445 nm范围内进行最大激发波长（EX）的扫描，3种喹诺酮类药物混合标准溶液的最大激发波长为351 nm，最大发射波长为465 nm，结果如图2所示。

图2 喹诺酮类混合标准溶液的激发和发射荧光光谱图

2.2 液相色谱流动相梯度洗脱条件的优化

根据喹诺酮类药物性质及相关文献[6-8]，选取C18色谱柱作为3种喹诺酮类药物的分离柱，以0.1%磷酸的水溶液（三乙胺调pH 2.8）-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，每次进样量10 μL，流速1 mL/min，通过对比0.1%磷酸水溶液和甲醇不同配比构成的流动相，结合实际样品中杂质出峰时间在3～8 min，保证3种喹诺酮类药物出峰的保留时间在10～15 min，以及色谱峰分离度大于1.5，流动相梯度洗脱条件如表1所示，色谱流出曲线如图3所示。

表1 高效液相色谱流动相梯度洗脱条件

图3 梯度淋洗喹诺酮类药物色谱图

2.3 提取液种类的选择

辣条主要成分为小麦粉、辣椒、香辛料及防腐剂等，由于其基质及食品添加剂复杂，因此在样品前处理过程中，提取液的选择极为重要。根据待测组分的性质及相关文献[9-12]，准确称取2 g加标辣条置于15 mL离心管中，按照试验方法分别加入10 mL含1%乙酸的乙腈溶液、含10%高氯酸的乙腈溶液、乙酸乙酯和EDTA-Mcllaine缓存溶液4种提取液提取辣条中喹诺酮类药物并进行优化，通过试验发现乙酸乙酯会提取出较多的油脂，多次脱脂会导致待测组分的损失；含10%高氯酸的乙腈作提取液时，由于高氯酸沸点高，在氮吹仪中无法挥发浓缩，且高氯酸酸性太强，不宜进入色谱柱；1%乙酸的乙腈溶液提取效率明显高于EDTA-Mcllaine缓存溶液，1%乙酸的乙腈溶液提取液对喹诺酮类药物提取效率在80%～98%之间，因此选取1%乙酸的乙腈溶液作为试验提取液。

2.4 提取液用量的选择

分别准确称取2 g加标辣条置于15 mL离心管中，按照试验方法考察分别加入5.0，7.5，10.0和12.5 mL含1%乙酸的乙腈溶液对喹诺酮类药物提取效率，每组提取剂平行3次试验，不同提取剂用量对提取效率的影响如图4所示。

试验表明随着提取液用量的增加，喹诺酮类药物提取效率随之增加，用量10.0 mL时样品中喹诺酮类物质基本上被提取出来，因此最佳提取剂用量为10.0 mL。

2.5 超声提取时间的选择

为加快提取时间，试验采用超声波提取仪提取辣条中喹诺酮类药物。分别准确称取2 g加标辣条置于15 mL离心管中，分别考察超声提取时间5，10，15和20 min，按照试验方法进行提取试验，每组提取剂平行3次试验，不同超声提取时间对提取效率的影响如图5所示。

超声波作用时间越长，界面扩散层上分子扩散越快，喹诺酮类药物提取率随着超声时间增大呈现增加趋势，超声15 min提取率达到最大值；但过长的超声时间使提取温度升高，有可能导致待提取组分分解损失。因此，确定超声提取时间15 min。

2.6 提取温度的选择

分别准确称取2 g加标辣条置于15 mL离心管中，按照试验方法分别考察提取温度40，50和60℃对喹诺酮类药物的影响，每组平行3次试验，不同提取温度对提取效率的影响如图6所示。

通过试验发现，超声提取温度50℃时喹诺酮类药物提取率达到最大，但提取温度过高，超声的空化效应可能减弱，提取率反而降低。因此，试验选择超声提取温度50℃。

图4 提取液用量对提取率的影响

图5 超声提取时间对提取率的影响

图6 提取温度对提取率的影响

2.7 标准曲线及方法检出限和定量限

分别移取3种10 μg/mL的喹诺酮类药物标准溶液，用甲醇依次稀释成0.1，0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 μg/mL呈倍数增长的混合标准工作溶液，按照液相色谱测试条件绘制喹诺酮类药物工作曲线，稀释混合标准溶液接近试剂空白进行方法检出限试验，试验结果如表2所示。

表2 3种喹诺酮类药物液相色谱分析法相关参数

3 样品分析

在重庆某小学门口购买某品牌长寿面（样品A）辣条、某品牌面筋（样品B）辣条、某品牌叫花鸡（样品C）辣条和某品牌羊肉串辣条（样品D）4个辣条产品，按照试验方法提取辣条中喹诺酮类药物及液相色谱条件分析实际样品中喹诺酮类药物，4个辣条产品试验结果如表3所示。

表3 辣条样品中喹诺酮类药物含量 μg/mL

通过试验发现每个品牌的辣条产品中均含有2种及以上不同喹诺酮类药物，由于不同类别的产品基质及食品添加剂不同，其基质效应对喹诺酮类药物的回收率有一定影响。但是，辣条样品种检测出喹诺酮类药物均属于违规添加行为，对青少年的成长势必造成潜在健康风险。

4 结论

针对青少年、儿童喜欢的辣条食品，试验建立一种快速、准确检测辣条产品中喹诺酮类药物的液相色谱分析方法，该方法能在短时间内同时检测不同种类辣条中违规添加的喹诺酮类药物，为国家职能监管部门制定辣条产品检测喹诺酮类抗生素药物提供一定科学技术依据。