正交优化超声辅助双水相法粗提雪菊色素

李娜，夏娜，王玉涛，朱思明, *

1. 喀什大学生命与地理科学学院（喀什 834000）；2. 华南理工大学食品科学与工程学院（广州 510641）

雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）学名蛇目菊，为高寒野生植物，有极高药用价值。中药记载雪菊有解毒、化瘀及健脾的功效；现代研究发现，雪菊有降脂、将压、降糖、改善胰岛素敏感性等药理作用[2]。此外，雪菊有养生、保健功能，泡茶可治口渴、肠胃不适、痢疾、疮疖等[3]。国内外研究者在雪菊理化性质、栽培等方面开展大量研究，取得一定成果，为开发雪菊经济价值提供理论指导。

雪菊的提取方法包括水或醇浸提、回流、超声、微波、超临界、亚临界水技术，并辅助响应面优化、随机质心映射优化、正交等技术研究最佳提取工艺。总黄酮含量测定方法主要有ZrOCl2法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法、AlCl3、HCl-Mg粉法、差示分光光度法、FS、TLCS、HPLC及毛细管电泳等。有研究表明，差示分光光度法测定结果与HPLC法相符，表明该法测定结果准确，操作简单，有良好的稳定性、重复性[13]。因此，试验采用差示分光光度法，试验发现，标准品和样品的最大吸收波长不一致，对2种波长下所得数据进行拟合，测定样品含量。

因传统双水相技术所用聚合物黏度大、成本高、效率低、目标物回收处理困难[5]，应用受限。改进后的低级醇-盐双水相系统可攻克上述弊端，又有易于放大、可连续化操作、易集成及绿色环保及组成多样等优点，被应用于天然代谢物的提取分离[5]。应用较多的是乙醇或正丙醇与无机盐组成的双水相体系，并辅助超声、微波等技术优化分离工艺，不仅可以简化分离工艺且提高分离效率。国内外关于雪菊色素提取的报道较少。此外，由于合成色素对环境、人体健康危害越来越大，天然色素的应用越来越普及，市场需求越来越大。近年来，雪菊已广泛种植，因此合理开发雪菊的商业价值尤为重要。试验以雪菊为研究对象，采取正丙醇（NPA）/硫酸铵构造双水相系统（ATPS）辅助超声波技术粗提雪菊色素，并借助正交试验确定最优提取条件，研究双水相应用于实际生产的可行性，为工业生产提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雪菊（喀什市东巴扎市场）；芦丁标准品（批号B20771，纯度HPLC≥98%，Shanghai Yuanye Bio- Technology Co.，Ltd.）；正丙醇（分析纯，Aladdin Reagent Co.，Ltd.）；硫酸铵（分析纯，天津大茂化学试剂厂）；ZrOCl2·8H2O（分析纯，阿拉丁试剂有限公司）；蒸馏水。

滴定管；移液管；分析天平（BSA223S，Sartorius Scientific Instruments Co.，Ltd.）；电子秤（JJ1000，常熟双杰测试仪器厂）；容量瓶；超声清洗仪；紫外可见分光光度计；0.45 μm水系针头滤器、有机系针头滤器（0.45 μm，25 mm；AMERITECH SCIENTIFIC）；分液漏斗；具塞磨口锥形瓶；量筒

1.2 试验方法

1.2.1 雪菊预处理

纯净干燥的雪菊粉末，过20目筛，再过100目筛，分成2份，密封袋保存备用。

1.2.2 双水相分相

一些小分子醇与一些无机盐水溶液作用可形成ATPS。刘磊磊等[9]发现NPA的分相能力大于异丙醇、乙醇；对比K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4分相能力发现均能构成ATPS，其中(NH4)2SO4分相能力最佳，可于盐量较少情况下分相，故试验选择NPA和(NH4)2SO4构造ATPS。采用浊点法绘制ATPE相图，操作步骤为：精密称取9.000 0 g左右的(NH4)2SO4于小烧杯中，滴定管加入一定体积的水（13.55 mL）至(NH4)2SO4溶解，形成(NH4)2SO4溶液；磁力搅拌器搅拌下，滴定管缓慢滴加NPA至溶液出现浑浊即为滴定终点，记录NPA加入量；向体系加入一定体积的水至溶液澄清，记录水的加入量，向澄清液滴加一定体积NPA至浑浊，记录NPA加入量，如此反复操作，结果见图1。

1.2.3 雪菊中色素的双水相提取

准确称取一定量(NH4)2SO4于250 mL具塞锥形瓶中，加定量蒸馏水，振荡溶解；加入一定量NPA，建立总质量20.0 g NPA/(NH4)2SO4ATPS[5]，称取一定量雪菊粉末加入到已构建的20.0 g体系中；用超声清洗仪在一定温度和时间下萃取。萃取结束，放置一段时间，等上下相完全分层，分液漏斗过滤，分别读取上下相体积，分得的醇相和水相分别过有机滤膜和水膜。

1.2.4 单因素试验

根据步骤1.2.3，分别研究(NH4)2SO4质量分数（25%，26%，27%，28%，29%和30%），NPA质量分数（20%，21%，22%，23%，24%和25%），雪菊粉末用量（0.02，0.04，0.05，0.06，0.08和0.10 g）、pH（1，3，5，7和9）、超声温度（20，30，40，50和60℃）及时间（20，40，60，80和90 min）6个因素对雪菊色素提取的影响。

1.2.5 正交试验

根据单因素试验结果，对(NH4)2SO4质量分数、NPA质量分数、雪菊粉末用量、温度、时间、pH进行正交试验考察，每个因素3个水平，优选雪菊色素提取工艺，用正交设计助手（Latin）设计试验方案，因素水平表如表1。

图1 正丙醇/硫酸铵双水相图

表1 正交试验因素水平表

1.2.6 雪菊色素含量测定

提取后的雪菊色素主要富集于上相，下相含量较少（对雪菊色素提取液上相和下相分别显色，发现下相中色素含量很少，后续试验采用上相溶液测量）。上相过0.45 μm有机滤膜，以总黄酮为指标测量雪菊色素含量。

1.2.6.1 芦丁对照品溶液的制备

准确称取芦丁标准品10.3 mg，加少量60%乙醇，超声溶解，转移至50 mL容量瓶中，60%乙醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度0.206 mg/mL的芦丁对照品储备液。

1.2.6.2 芦丁最大波长的测定

准确量取2份3 mL芦丁储备液于25 mL容量瓶中，一份加60%乙醇溶液稀释至刻度做参比；另一份加4 mL质量分数2% ZrOCl2·8H2O乙醇液[13]，并用60%（质量百分数）乙醇溶液稀释至刻度，摇匀放置1 h，于波长范围250～700 nm内扫描测定。结果显示，显色前后对照品在440 nm处有最大差示吸光度。另取雪菊色素供试品有机相溶液0.3 mL 2份，同上述步骤，扫描样品络合前后的差示吸收光谱。结果提示，雪菊色素样品溶液显色后在413 nm处有最大差示吸光度，由此发现，对照品和供试品溶液显色后的差示吸收光谱不同，故分别测定对照品和供试品在413和440 nm处的吸收差值。

1.2.6.3 芦丁标准曲线的制备

准确移取芦丁储备液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL各2份置于10 mL容量瓶中，同1.2.6.2法显色，放置1 h，分别于413和440 nm处测定各组溶液显色后差示吸光度，同一浓度下不同波长处的吸光度相减，并以此为纵坐标，以对照品溶液质量浓度为横坐标（mg/mL），绘制标准曲线。

1.2.6.4 雪菊色素得率的计算

按方法1.2.3制备雪菊色素，取0.3 mL有机相溶液2份于25 mL容量瓶中，按1.2.6.2的方法显色，静置1 h，在413和440 nm处分别测定相应的差示分光光度值。按照回归方程，通过吸收度差值计算被测液中色素含量。

式中：C为线性方程计算出的质量浓度，mg/mL；V0为分离后的醇相或水相体积，mL；V为测定所吸取稀释液体积，mL；m为称取的样品质量，mg。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线

按1.2.6.3的方法求得回归方程为ΔA=7.253 8C+ 0.009 18（R2=0.993 71），表示芦丁质量浓度在0.008 24～0.028 84 mg/mL之间，和相应的吸收度差值线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 (NH4)2SO4质量分数的影响

如图2，在25%～28%范围内随(NH4)2SO4质量分数增加，雪菊色素得率呈现下降趋势，可能是由于体系中(NH4)2SO4质量分数增加，盐的助溶作用也增加，因此雪菊色素不断富集于水相。(NH4)2SO4质量分数28%时，与水相体积相比，发现醇相体积相对减少，可能是由于此时分相能力较弱，色素大量溶解于水相或提取不充分，这与28%处色素得率低的结果一致。

2.2.2 正丙醇质量分数的影响

试验结果见图3，随NPA质量分数增加，雪菊色素得率出现先下降后增加又逐渐下降现象，可能是由于NPA本身具有良好的分相能力，很大程度上影响雪菊色素的分离，随着NPA含量增加，使得雪菊中更多的脂溶性物质等溶出，溶液中色素含量相对减少。

图2 (NH4)2SO4质量分数对雪菊色素得率的影响

图3 正丙醇质量分数对雪菊色素得率的影响

2.2.3 雪菊粉末用量的影响

从图4可以看出，在雪菊粉末用量小于0.08 g，雪菊色素得率总体上呈现升高趋势，这说明有利于雪菊色素的提取分离。雪菊粉末用量大于0.08 g，提取率出现减少趋势，可能是因为随着雪菊粉末加入增多，雪菊中大量的糖类、果胶等物质溶出，对雪菊色素的分离造成干扰，从而减弱双水相对雪菊色素的分离。

图4 雪菊粉末用量对色素得率的影响

2.2.4 超声温度的影响

由图5可以看出，在前30 min，雪菊色素得率随温度升高而升高，30 min以后有所下降，可能是因为随着温度升高，糖类等多数成分均不同程度的溶出并分配到双水相体系中，影响色素分离。但40 min以后雪菊色素得率有不同程度上升，可能随温度升高，雪菊细胞壁大量破裂，基质中色素大量扩散到溶液中；此外，随温度升高，分子热运动逐渐加剧，色素物质在浓度差的作用下扩散到溶液中便越来越容易，因此得率相对增加。

图5 温度对雪菊色素得率的影响

2.2.5 超声时间的影响

从图6可知，40 min之前，雪菊色素得率随着超声时间增加逐渐增加，40～80 min之间，雪菊色素得率变化不大，可能在此时间段内，雪菊色素提取分离达到饱和。80～90 min时，得率有不同程度增加，可能因为时间越久，超声越完全，分子运动产生的热能逐渐升高，使得更多物质溶出，尤其结合型的色素类物质，故色素得率上升。

2.2.6 pH的影响

如图7所示，pH对雪菊色素得率作用较大，在强酸条件下，雪菊色素得率随pH增加而增加，可能是因为酸性条件利于结合型黄酮苷类物质的水解，使得溶液中游离的黄酮类物质增加；在碱性条件下，雪菊色素得率显著降低，可能是因为，色素中大量黄酮苷类成分、蒽醌苷类等含有大量酚羟基的结构，因酚羟基的存在，一方面增强其酸性，使得水相中溶解度增大；另一方面，蒽醌苷类成分因其酚羟基和羰基的存在可在碱性条件下形成共轭体系，改变其化学结构，从而使溶液显红色或紫红色，这在试验提取结果中得到证实。因此强碱性条件下提取到的雪菊色素在水相含量增大，在有机相却减少。

图6 时间对雪菊色素得率的影响

图7 pH对雪菊色素得率的影响

2.3 雪菊色素提取工艺正交优化试验

按照上述结果，选取(NH4)2SO4质量分数（A）、NPA质量分数（B）、雪菊粉末质量（C）、温度（D）、时间（E）、pH（F）进行六因素三水平正交试验，L18(36)试验设计与结果见表2。

表2 正交试验结果

接表2

由极差R可以得出，影响雪菊色素得率的因素主次关系是F＞D＞C＞A＞B＞E。雪菊色素最佳提取条件为A3B3C2D3E1F1；开展重复试验3次，结果如表3。结果显示RSD为4.413%＜5%，平均得率为240.146 9 mg/g。这表明超声辅助双水相正交优化粗提雪菊色素，以总黄酮为测量指标，该工艺可行，重现性较好。

表3 重现性试验结果

2.4 精密度试验

准确移取3 mL 2份芦丁储备液于25 mL容量瓶中，根据1.2.6.2所述显色，1 h后，于413和440 nm处测定络合后的吸光度，结果如表4，显示仪器精密度较好。

表4 精密度试验结果

2.5 稳定性试验

按最佳方案，开展稳定性试验，按1.2.6.2法显色。室温下放置一定时间，测定吸光度，RSD是3.04%，说明供试品中雪菊色素在2 h内稳定，结果如表5。

表5 稳定性试验结果

2.6 重现性试验

按照2.3下重复试验操作，测定其吸光度，计算RSD，结果见表4。RSD为4.413%，表明该方案可行，重现性较好。

3 结论与讨论

研究正交优化超声辅助NPA/(NH4)2SO4ATPS粗提雪菊色素的工艺条件。确定以总黄酮为指标时最佳工艺为：20 g ATPS中(NH4)2SO4质量分数29%，正丙醇质量分数23%，雪菊粉末用量0.08 g，温度60℃，时间60 min，pH 3。验证性试验结果表明，差示分光光度法用于雪菊色素中总黄酮的检测可行，雪菊色素得率为240.146 9 mg/g，总体来说高于文献中雪菊总黄酮提取率[5,15,21]，但比邱佳俊[2]所用方法提取率58.95%显著低，说明试验还需要改进。此外，超声辅助双水相法粗提雪菊色素可以相对提高雪菊色素分离效率，且试验所用溶剂较少，提取时间较短，安全绿色环保，所需工艺设备要求低，操作简单，成本较低，为雪菊色素的工业生产提供一定理论基础。