不同保存方式对标本常规生化项目检测结果的影响

王 艳,任 娜,张 伟,蔡艳英,刘 颖,胡立新,李文瑄,宋文琪

(国家儿童医学中心/首都医科大学附属北京儿童医院检验中心，北京 100045)

随着实验室硬件设施和实验室质量管理水平的提升，临床、患者及实验室工作人员对标本检测结果的准确度的要求也在不断提高。在临床反馈不满意的检验结果中，经追踪调查60%～80%为标本质量不符合要求[1]。因此在分析前确保标本质量符合要求尤为重要。在实验室最为理想的情况是标本接收后及时处理并检测，以期待检测结果能最贴近患者体内真实水平。但在仪器发生故障、实验室内、实验室间比对或样本量少、等待批量检测过程中均需要对标本进行暂时保存。选择适当的保存方式是保证标本质量的关键。而国内外对标本保存方式评估分析结果不尽相同。本研究对实验室常见的室温、冰箱冷藏和冰箱冻存3种标本保存条件下常规生化项目检测结果稳定性进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 室温与冰箱冷藏标本制备与检测 2016年7月32名科室工作人员作为志愿者，在清晨空腹抽取静脉血，每人抽取10 mL，分2支于含分离胶促凝管中。室温静置30 min，3 000 r/min离心15 min后上机检测，将检测结果作为0 h时结果。之后将标本加盖分别置于室温24～25 ℃和2～8 ℃冰箱冷藏环境，并于2、4、6和8 h后分别检测，并记录检测结果。

1.1.2 -80 ℃冰箱冻存标本制备与检测 2019年4月选取儿童生化检测后无溶血、乳糜标本，将同一年龄儿童血清标本进行混合，每支混合血清不少于8 mL，共制备第一批混合血清标本22支。将22支标本充分混匀后，每支分装为8份于标本保存管内，取一份当时进行生化检测，其余7份于-80 ℃冻存，之后每隔1周取1份进行检测。据上次第1批标本留存1周后，按上面同样方法留存第2批标本，并按同样方式进行冻存和检测。之后间隔1周再留存检测第3批标本。3批标本均保持在同一天下午检测，且采用同一瓶检测试剂，同一台设备。

1.2 仪器与质控 冰箱冷藏和室温保存标本检测采用AU2700全自动生化分析仪，-80 ℃冷冻保存标本检测采用AU5821全自动生化分析仪。室内质量控制品均采用伯乐质控品，检测前后均运行质控品且质控结果在控。

1.3 方法 钾(K)、钠(NA)、氯(CL)采用离子选择电极法进行检测；碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、L-γ- 谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)、肌酸激酶(CK)、胆碱酯酶(CHE)采用速率法进行检测；肌酐(CR)、游离脂肪酸(NEFA)采用酶法进行检测；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用直接法进行检测；总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、尿素(UREA)、尿酸(UA)分别采用双缩脲法、溴甲酚绿法、脲紫外速率法、酶比色法进行检测；钙(CA)、磷(P)、镁(MG)分别采用偶氮砷三法、磷钼酸比色法、二甲苯胺蓝法进行检测；胆固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、葡萄糖(GLU)分别采用胆固醇氧化酶法、GPO-PAP法、己糖激酶法进行检测。

2 结 果

2.1 室温24～25 ℃下不同保存时间对标本常规生化项目检测结果的影响 32份标本在0、2、4、6和8 h后检测，K、NA、CL、ALB、CR、CA、P、ALP、CHO、HDL-C、LDL-C、CK、GLU、CHE的CVmax均小于或等于CV室内，表明以上项目在8 h室温内保存结果稳定。TP、MG、UA和HBDH的CVmax虽大于CV室内，但其基本在CV指标范围内，说明其变异是可接受的。对于其他CVmax不在控制范围内的项目，通过线性回归分析，发现不同保存时间的LDH和NEFA水平差异有统计学意义(P<0.05)，其水平随保存时间延长而升高。见表1、2。

表1 室温下在不同保存时间各项目检测结果均值

表2 室温下各项目检测结果与保存时间的线性回归及检测结果CV分析

注：-表示无数据。

2.2 冰箱冷藏不同时间对标本常规生化项目检测结果的影响 32份标本在2～8 ℃冰箱冷藏0、2、4、6和8 h后检测，K、NA、CR、CA、ALP、MG、CHO、HDL-C、LDL-C、CK、GLU和 CHE的CVmax均在室内质控的不精密度范围内，表明以上项目在8 h冰箱内冷藏保存结果稳定。TP、ALB、P、AST、CHO、TG、UA和HBDH的CVmax虽大于CV室内，但其基本在CV指标范围内，说明其变异是可接受的。对于CVmax不在控制范围内的项目，通过线性回归分析，不同保存时间下UREA和NEFA水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中NEFA水平随保存时间延长而升高，UREA则降低。见表3、4。

表3 在 2～8 ℃冰箱内不同保存时间各项目检测结果均值

续表3 在 2～8 ℃冰箱内不同保存时间各项目检测结果均值

2.3 冰箱冷冻保存对标本常规生化项目检测结果的影响 3批标本在0～7周-80 ℃冰箱冷冻保存过程中，K、NA、CL、TP、ALB、CA、P、MG、CHO、HDL-C和LDL-C的CVmax均小于或等于CV室内，表明以上项目在-80 ℃冻存结果稳定。此外，AST、GGT、ALP、TG、UA、HBDH、LDH和CHE的CVmax虽大于CV室内，但其基本在CV指标范围内，说明其变异是可接受的。对于其他变异不在控制范围内的项目，通过线性回归分析，发现UREA和ALT仅在第3批标本中其不同保存时间检测结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其r2分别为0.759和0.660。见表5。

对CVmax超过质量指标要求的项目UREA、CR、ALT、CK、GLU分别以每批检测结果均值为纵坐标，以保存时间为横坐标作图，结果见图1。5个项目3批标本在同一时间检测结果呈现相同变化趋势，考虑为检测系统变异。对UREA、CK和GLU通过计算3批数据箭头所示时间点的波峰或波谷点与前一个点的平均偏移，再对波峰或波谷点数值扣除平均偏移所得校正值后计算连续7周的CV。因CR和ALT测定水平偏低，对3批标本中ALT>20 U/L的ALT检测结果和CR>20 μmol/L的CR检测结果进行再次CV统计分析。上述5个项目校正和重新分析结果见表6。校正和重新分析后的CVmax基本在CV指标范围内。

表4 冰箱冷藏时各项目检测结果与保存时间的线性回归及检测结果CV分析

续表4 冰箱冷藏时各项目检测结果与保存时间的线性回归及检测结果CV分析

表5 3批标本在冰箱冷冻保存7周的常规生化项目检测结果的CV及线性回归分析

表6 UREA、CR、ALT、CK和GLU校正与重新分析结果(%)

注：A～E分别为-80 ℃保存UREA、CR、ALT、GLU、CK均值变化；1、2、3表示第1批、第2批、第3批；箭头所示方向为3批标本在同一时间均值变化。
图1 -80 ℃保存UREA、CR、ALT、GLU、CK均值变化

3 讨 论

生化检测是医院常规血液检测项目,其检测结果的准确度与标本质量密切相关。而标本质量受患者状态、标本采集、处理和保存的影响。标本处理后最好是及时检测，但在仪器故障、进行标本比对或选择批量检测过程中均需要对标本进行暂时保存，选择适当的保存方式是保证标本质量的关键。本研究对室温、冷藏和冷冻3种常见的血清标本保存方式下常规生化项目结果的稳定性进行了研究，提供了相关的数据支持。

有研究报道室温25 ℃和4 ℃下分离后血清标本常规生化项目检测结果可稳定12 h[3-4]。采用分离胶促凝管保存的血清样本室温保存6 h时ALT和K升高,4 ℃下TP和GLU升高[5]。同时也有研究报道室温下标本保存超过6 h,电解质升高，ALT和AST水平明显下降[6]。本研究中血清标本在室温24～25 ℃或2～8 ℃下放保存8 h，大部分常规生化项目检测结果变异在可接受范围内，特别是K、NA、CR、CA、ALP、CK、GLU、CHE、CHO、HDL-C、LDL-C的CV控制在室内不精密度范围内，表现了良好的稳定性。但需要注意的是LDH、NEFA和UREA。NEFA无论在室温保存和冰箱冷藏，均呈现升高趋势，同时室温保存NEFA水平8 h后升高更加显著，冰箱冷藏4 h基本稳定，保存8 h后NEFA水平可升高，与陈益川等[7]报道结果基本一致，而NEFA水平升高是源于脂类间的转化[8]。研究中LDH水平在室温下出现明显升高，冷藏时不明显，可能与红细胞内LDH的释放有关。有研究报道分离胶储存管可有效分隔血清和红细胞，但采用分离胶管保存血清进行葡萄糖检测时，其检测结果随保存时间延长而降低[9]。而王丹凤等[10]报道将分离后的血清标本置于2～8 ℃保存，72 h内LDH检测结果与采集后即刻分离血清检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，也说明分离胶管可能存在干扰。在室温和冰箱冷藏保存8 h UREA水平呈下降趋势，其原因可能与尿素的分解挥发有关。

本研究中分离后血清标本在-80 ℃保存时大部分常规生化项目检测结果CV都在可接受范围内，与其他研究结果报道一致[11-12]。对于CV超过可接受范围项目UREA、CR、ALT、CK、GLU进一步的分析中发现，3批UREA、CK和GLU的均值变化曲线一致，说明检测系统带来的变异是造成结果偏倚的重要原因，通过对测定结果进行检测系统偏倚校正后，3个项目的CV基本在可接受范围内。当ALT>20 U/L和CR>20 μmol/L时,两个项目的CV是可接受的。

在标本保存方式对检验结果的影响研究中，大多数研究均采用t检验进行结果均值的比较[3-6，10,12-15]，但该方法缺乏不同保存方式下检测结果变异可接受性的分析。本研究首次将在不同保存方式下所得检测结果的变异与室内不精密度和临床生物化学检验常规项目分析质量指标结合起来，记录每个独立样本的变异，并以CVmax来表示一批样本的变异情况，以线性回归来分析结果的变化趋势，为生化项目结果变异的评估提供了新思路。

本研究中在-80 ℃冰箱冷冻保存血清标本制备过程中，为避免不同年龄段儿童各项目水平的差异及可能因年龄原因造成的物质类型不同的干扰，每一支标本均来自同一岁年龄。结果表明通过该方法制备的混匀血清标本在生化项目上具有较好的稳定性，该方法为组织实验室内和实验室间比对提供了标本制备思路。

本研究证实分离胶储存管离心后除UREA、LDH和NEFA外，其他常规生化项目在室温25 ℃和2～8 ℃下保存8 h的检测结果的变异均控制在可接受范围，LDH和NEFA水平呈升高趋势，UREA水平降低。分离后儿童血清-80 ℃保存7周，常规生化结果基本保持稳定，ALT测定结果低于20 U/L，CR低于20 μmol/L时会出现超过质量指标要求的变异。如果标本需要长期保存，血清分离后-80 ℃冰箱冷冻保存是最好的保存方法。在儿童血清标本少的情况下，各年龄段儿童混匀血清为开展儿童相关项目研究提供了标本制备方法。