1-脱氧野尻霉素对高脂饮食肥胖小鼠脂代谢的改善作用

杨忠敏 曾艺涛 丁晓雯 黄先智

（1 西南大学食品科学学院 重庆市农产品加工重点实验室 重庆 400716 2 西南大学科技处 重庆 400716）

肥胖是热量摄入与消耗不平衡而导致的一种健康问题，其主要特征是体内过多脂肪堆积，从而诱导脂代谢异常[1]。近年来，肥胖在全球流行疾病中的比例显著上升[2]。Karami 等[3]统计分析表明，饮食与肥胖存在极显著性相关（P＜0.001）。已有研究证明，肥胖是一些非传染性疾病的危险因素，如2型糖尿病、肿瘤、非酒精性脂肪肝以及高血压等[4]。世界卫生组织已将肥胖列入2013-2020 年非传染性疾病预防和控制的全球计划中[5]。肥胖的预防控制已成为食品和分子营养学研究的核心问题。

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一种哌啶类多羟基生物碱[6]，主要来源于植物，如桑叶、动物、微生物及人工合成。近年来，国内外学者研究表明，DNJ 具有降糖、抗病毒等作用[7]。Tsuduki 等[8]2009 年通过给高脂饮食诱导肥胖小鼠灌胃DNJ（1.06 mg/kg bw/d）12 周，结果表明，DNJ 通过激活β 氧化系统抑制肝脏脂质积累，不会导致肝功能障碍，首次提出DNJ 具有抗肥胖效应。2013 年Tsuduki 等[9]继续深入研究，通过给雄性小鼠灌胃DNJ（5 mg/kg bw/d）12 周，研究DNJ对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂代谢紊乱的影响，结果发现，DNJ 促使血浆增强脂联素，降低甘油三脂（Triglyceride，TG），抑制肝脏中脂质的积累，进而防止饮食引起肥胖。Wang 等[10]通过体外实验研究表明，桑叶中DNJ 通过ERK/PPARγ 信号通路抑制猪肌内脂肪细胞脂肪生成。Do 等[11]通过从枯草芽孢杆菌分离DNJ，给高脂饮食诱导的雄性肥胖小鼠灌胃DNJ（10 mg/kg bw/d）12 周，结果表明，DNJ 能改善肝脂代谢异常，控制体重。目前虽有一些DNJ 对脂代谢影响的研究，但对具体的信号抑制途径和影响脂代谢的框架结构尚未建立。

本研究通过给小鼠饲喂高脂饮食，建立小鼠肥胖模型，并持续饲喂高脂饲料，模拟人类高脂饮食造成肥胖后并不积极控制饮食的模式，同时灌胃不同剂量的DNJ，探讨DNJ 对这种饮食模式的小鼠脂代谢的影响及其机理，为DNJ 降脂功能产品的开发和机理研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物与饲料 100 只4 周龄昆明种清洁级小鼠（雌雄各半，体重（20±2）g），重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司（许可证号：SCXK（渝）2007-006）。

基础饲料，重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司；高脂饲料，自制，配方：基础饲料78%、白糖10%、猪油10%、胆固醇2%[12]。

1.1.2 主要试剂 DNJ（纯度≥98%），北京德威钠生物技术有限公司生产；脂联素（Adiponectin，ADP）、内脂素、游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）、脂肪合成酶（Fatty acid synthetasein，FAS）、酰基辅酶A 氧化酶（Acyl-CoA oxidase，ACO）、乙酰辅酶A 羧化酶（Acetyl Coa carboxylasec，ACC）、肉毒碱脂酰转移酶Ⅰ（Carnitine palmitoyl transferase-1，CPT-1）ELISA 试剂盒，厦门慧嘉生物科技有限公司；TG、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（High density liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒，四川迈克生物技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

7020 型全自动生化分析仪，日本日立公司；zhengy H1 型酶标仪，Gene Company Limited；F6/10 型匀浆机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；H2500R-2 型冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNJ 的配制 分别称取一定量的DNJ 标品溶于0.9%的NaCl 溶液中，配制成质量浓度分别为0.2，0.4，0.8 mg/mL 的DNJ 溶液，4 ℃保存备用。

1.3.2 肥胖小鼠模型的建立 100 只4 周龄昆明种小鼠，用基础饲料适应性喂养5 d，然后饲喂高脂饲料4 周，用于建立肥胖模型[13]。当造模小鼠肥胖度＞20%，且与对照组小鼠存在显著性差异时，认为建模成功。剔除肥胖度不够的小鼠。根据公式（1）计算肥胖度：

1.3.3 肥胖小鼠分组及饲养[14]随机挑选80 只造模成功的肥胖小鼠（雌雄各半），随机分为4 组，每组20 只（雌雄各半），即高脂对照组，DNJ 的低、中、高剂量组，根据预实验的结果设置DNJ 灌胃剂量。各剂量组按5 g/d/只喂饲高脂饲料，自由饮水，1 周换2 次垫料，5 d 称1 次体重。保持室温（22±2）℃，12 h 轮换照明（7：00-19：00），通风良好。肥胖模型小鼠分组及喂饲如表1 所示。

表1 肥胖模型小鼠分组及喂养Table 1 Grouping and feeding of obesity model mice

1.4 样本采集及指标测定

1.4.1 血液及组织样本的获取 小鼠灌胃40 d，禁食不禁水12 h，眼球取血后将小鼠脱颈椎处死，解剖，摘取肝脏和腹腔脂肪组织，按参考文献[9]处理后称重。

小鼠腹腔脂肪系数计算公式见参考文献[15]。

1.4.2 指标测定 按参考文献[16]处理血样，在全自动生化分析仪上测定血脂水平；用ELISA 试剂盒进行血清FFA、内脂素、ADP 的测定。

以1∶7 的质量比向肝脏中加入PBS 缓冲液（pH 7.4）进行匀浆，3 000 r/min 离心20 min，取上清液按照ELISA 试剂盒的方法测定肝脏中FAS、ACO、ACC、CPT-1 的活性。

肝脏脂肪含量的测定：将滤纸放入烘箱，100℃烘干至恒重，放入干燥器中冷却后，称取其质量为m。准确称取已碾磨的肝脏样品质量m1，用已称好的滤纸将样品包裹好，防止肝脏样品漏出。将纸包放入100 mL 带盖玻璃瓶中，加入20 mL 沸程60～90 ℃的石油醚，旋紧瓶盖，在功率100%、超声温度55 ℃条件下超声40 min，如此重复3 次，完毕后将纸包取出，105 ℃烘干至恒重，放入干燥器中冷却后称重m2[17]。根据公式（2）计算肝脏脂肪含量：

1.5 数据分析

2 结果与分析

2.1 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠体重的影响

由图1 可知，在造模成功时（0 d），与正常对照组相比，其余4 组小鼠体重与其均存在极显著差异（P＜0.05），造模组小鼠间体重均无显著性差异（P＞0.05），表明高脂饮食会使小鼠肥胖。40 d 实验结束时，模型对照组雌、雄小鼠体重较正常组分别增加19.43%、39.16%（P＜0.05），DNJ 高剂量组较模型组雌、雄小鼠体重分别减少13.08%、24.41%（P＜0.05）。

体重是衡量动物健康状况的重要指标之一，过轻或过重都不利于健康。高脂饮食会造成小鼠营养性肥胖，从而加剧肥胖小鼠的脂代谢紊乱[18]。本研究结果表明DNJ 能调节肥胖小鼠体重使之恢复至与正常小鼠无显著性差异水平（P＞0.05）。

图1 DNJ 对雌（a）、雄（b）小鼠体重的影响（n=10）Fig.1 Effect of DNJ on body weight of female（a）and male（b）mice（n=10）

2.2 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠腹腔脂肪系数、肝脂肪含量的影响

由表2 可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠腹腔脂肪系数、肝脂含量均与之存在显著性差异（P＜0.05）。与高脂对照组比较，DNJ 灌胃剂量达到8.0 mg/kg d，雌、雄鼠的腹腔脂肪系数分别下降43.12%、21.49%（P＜0.05），肝脏脂肪含量分别下降12.76%、11.97%（P＜0.05）。

腹腔脂肪系数是腹腔脂肪与体重的比，其比值越小表示脂肪分解，反之，意味着脂肪合成受到促进作用。腹腔脂肪系数过大会增加心血管疾病发生的几率[19]。脂肪主要聚集于肝脏，而肝脂肪含量与胰岛素抵抗综合症密切相关[20-21]。Do 等[11]通过给高脂饮食诱导的雄性肥胖小鼠灌胃DNJ（10 mg/kg bw/d）12 周，结果表明，DNJ 显著降低小鼠体重、肝脂含量及附睾、肾、腹膜、肠系膜的脂肪含量。本研究结果显示，用8.0 mg/kg bw/d 的DNJ 灌胃高脂饮食的肥胖雌、雄小鼠40 d，能显著降低小鼠腹腔脂肪系数、肝脂含量，进一步证明DNJ 能有效增加腹腔脂肪的分解，减少肝脂肪含量积累，且有降低胰岛素抵抗综合症发生的可能性。

表2 DNJ 对高脂饮食的肥胖小鼠腹腔脂肪系数、肝脂肪含量的影响（n=10）Table 2 The effect of DNJ on abdominal fat coefficient and content of liver fat in obese mice with high fat diet（n=10）

2.3 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠脂代谢相关生化指标的影响

2.3.1 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 的影响 由表3 可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠TC、TG、HDL-C、LDLC 均与之存在显著性差异（P＜0.05）。与高脂对照组相比，在实验剂量范围内，DNJ 使高脂饮食肥胖雌雄鼠的TG、TC、LDL-C 水平呈现降低，HDL-C 含量呈现增加趋势。当DNJ 灌胃剂量达到8.0 mg/kg d 时，高脂饮食肥胖雌、雄小鼠血清TC 分别下降22.92%，8.81%（P＜0.05）；TG 分别下降23.03%，30.48%（P＜0.05）；LDL-C 分别下降52.78%，59.50%（P＜0.05）；HDL-C 分别上升37.65%，39.53%（P＜0.05），DNJ 对TG、TC、LDL-C、HDL-C 的影响无性别差异（P＞0.05）。

已有研究表明，血脂的变化与体内脂肪含量密切相关，很大程度上反应机体脂肪代谢情况[22]。TG、TC 为血脂的主要成分，血脂水平随其升高而升高，LDL-C、HDL-C 在调节血脂水平方面有重要作用，LDL-C 能将TC 输送至血液，血脂水平随其含量升高而升高；HDL-C 能促进胆固醇代谢，血脂水平随其含量升高而降低[23]。王玲等[24]建立高脂饮食小鼠肥胖模型，饲喂基础饲料以模拟肥胖后控制饮食的模式，灌胃DNJ（8.0 mg/kg bw/d）40 d 后，发现雌、雄小鼠的TC、TG 含量显著降低，雌鼠HDL-C 含量显著增加。本研究建立高脂饮食小鼠肥胖模型，并继续饲喂高脂饮食以模拟肥胖后控制饮食的模式，在王玲等[24]研究结果的基础上进一步证明了DNJ 对血脂水平有明显的调控作用，而该DNJ 对不同性别小鼠血脂调节存在差异的机理还有待深入研究。上述研究结果表明，DNJ对高脂饮食肥胖小鼠血脂代谢有一定的调节作用，其可能的调控机制：一方面DNJ 通过促进腹腔脂肪的分解，降低腹腔脂肪系数降低，降低肝脏脂肪合成，以减少肝脏脂肪积累；另一方面DNJ 通过提高血清中HDL-C 水平，HDL-C 运载血液中TG、TC 向肝脏运输，转化为胆汁酸，降低血清中TG、TC 水平。

2.3.2 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠FFA、内脂素、ADP 的影响 由表4 可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠FFA、内脂素、ADP 均与之存在显著性差异（P＜0.05）。与高脂对照组相比，各剂量DNJ可使雌、雄鼠的FFA、内脂素呈下降趋势，ADP 呈增加趋势，且有显著的剂量-效应关系。灌胃DNJ（8.0 mg/kg d）40 d 后，与高脂对照相比，雌、雄小鼠的FFA 分别下降16.25%，15.25%（P＜0.05），内脂素分别下降28.38%，23.36%（P＜0.05），且使雌、雄小鼠ADP 含量分别增加了35.53%，26.31%（P＜0.05），即DNJ 机体可以通过调控ADP 水平来参与脂代谢。在实验剂量范围内，DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠FFA、内脂素、ADP 的影响无性别差异（P＞0.05）。

中性脂肪能分解产生FFA，充当能量使用。已有研究表明，FFA 不仅是肝脏TG 的合成原料，也与酒精性脂肪肝发病机制相关[25]。内脂素是一种脂肪细胞因子，已有研究表明，内脂素主要产生于内脏，与TC 呈正相关，与HDL 呈负相关，是脂代谢的重要调控因子[26]。ADP 由脂肪组织分泌，内脏脂肪中含丰富的表达基因，参与脂代谢调节[27]。Lindberg 等[28]研究发现，血浆低ADP 水平会增加代谢综合征风险。本研究结果显示DNJ 降低肥胖小鼠FFA、内脂素水平，且增加ADP 含量，表明DNJ 可有效减少肥胖小鼠肝脏TG 合成的原料，保护肝细胞，使内脂素的变化与血清TC 降低、HDL升高的变化结果一致。

表3 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠血脂水平的影响Table 3 The effect of DNJ on blood lipid levels in obese mice with high fat diet

表4 DNJ 对高脂饮食的肥胖小鼠FFA、内脂素、ADP 的影响Table 4 The effect of DNJ on FFA，visfatin and ADP in obese mice with high fat diet

2.4 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠脂代谢相关酶活性的影响

由表6 可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠FAS、ACC、ACO、CPT-1 均与之存在显著性差异（P＜0.05）。与高脂对照组相比，灌胃DNJ（8.0 mg/kg d）40 d 后，雌、雄小鼠FAS 活性分别降低19.27%，19.60%（P＜0.05），ACC 活性分别降低30.75%，15.64%（P＜0.05），表明DNJ 可使机体脂肪沉积减少，抑制脂肪合成；而雌、雄小鼠ACO 活性分别升高3.8%，6.4%（P＜0.05），CPT-1 活性分别升高20.4%，17.2%（P＜0.05），表明DNJ 可使脂肪酸β 氧化，有利于脂肪分解。在实验剂量范围内，DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠FAS、ACC、CPT-1、ACO 活性的影响无性别差异（P＞0.05）。

FAS、ACC 的活性增强能加速机体脂肪沉积，对脂肪合成至关重要[29]。ACO、CPT-1 均能促进脂肪酸β 氧化，从而促进脂肪的分解[30]。Tsuduki 等[9]等通过给高脂饮食诱导的雄性肥胖小鼠灌胃纯DNJ（5 mg/kg bw/d）12 周，结果表明，DNJ 能显著降低FAA 含量，显著增加ADP，内脂素水平、CPT、ACO 活力显著增加。而本研究结果与Tsuduki 等[9]研究结果基本一致。本研究结果表明，DNJ 一方面通过抑制与脂肪合成有关的FAS、ACC 活性使肥胖小鼠体内脂肪合成受阻，减少TG积累；另一方面通过增加与脂肪氧化分解密切相关的CPT-1 活性，加速脂肪酸的β 氧化，促进脂肪分解，从而达到控制高脂饮食肥胖小鼠血脂水平的目的。

表5 DNJ 对高脂饮食肥胖小鼠肝脏中FAS、ACC、ACO、CPT-1 的影响Table 5 The effects of DNJ on FAS，ACC，ACO，CPT-1 in liver of obese mice with high fat diet

3 结论

DNJ 是桑叶中含量较高的一种生物碱。近年来国内外研究表明，DNJ 具有调节血脂的作用。本研究结果表明，DNJ 可以通过控制脂肪因子分泌及脂代谢相关酶活来抑制脂肪合成，促进其分解，进而达到调控高脂饮食肥胖小鼠脂代谢的目的。同时，DNJ 对不同性别小鼠脂代谢的调节作用无性别差异。