牛黄上清丸（大蜜丸）微生物限度检查法方法适用性试验研究

王 瑛，王丽霞，买买提·艾买提

（1.黑龙江省药品检验研究中心，黑龙江 哈尔滨 150001；2.哈尔滨市食品药品行政执法局，黑龙江 哈尔滨 150001；3.新疆哈密市食品药品检验所，新疆 哈密 839000）

对牛黄上清丸（大蜜丸）的处方及其制造工艺进行研究，检验牛黄上清丸（大蜜丸）之中生药原粉含量，应用《药典四部附录通则（2015版）》--1107相关标准进行判断，牛黄上清丸（大蜜丸）之中需氧菌总数≤3×104cfu/g，霉菌和酵母菌总数应≤102 cfu，沙门菌每10 g不得检出，大肠埃希菌每克不得检出，耐胆盐革兰阴性菌每克应＜102cfu[1]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

超净台生产厂家：AIRTECH，仪器型号：SW-CJ-2FD；电子天平生产厂家：METTLER，仪器型号：PL202-S；匀浆仪生产厂家：泰林生物技术设备有限公司，仪器型号：HTY-761；生物安全柜生产厂家：HealForce，仪器型号：Hfsafe-1200A2；电热恒温培养箱生产厂家：天津市泰斯特仪器有限公司，仪器型号：DH5000A；生化培养箱生产厂家：上海博迅实业有限公司医疗设备厂，仪器型号：SPX-250B-Z型；高压蒸汽灭菌器生产厂家：Panasonic，仪器型号：MLS-3781L-PC；培养箱生产厂家：上海精宏实验设备有限公司，仪器型号：MJPS-250；涡旋混合器生产厂家：IKA，仪器型号：VORTEX3。

1.2 培养基

培养基符合《中国药典》2015年版四部附录通则的相关规定[2]，包括胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖肉汤、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、RV沙门增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、肠道菌增菌肉汤培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基等。

1.3 菌株

全部所应用的菌株均为中国食品药品检定研究院提供的5代内菌种，包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希氏菌等。

2 方法和结果

2.1 微生物计数法适用性试验

采用胰酪大豆胨液体培养基实施铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌接种，培养后应用氯化钠溶液10倍递增稀释，菌悬液制成每含菌量≤104 cfu/mL；黑曲霉斜面混合5 mL聚山梨酯及无菌氯化钠溶液，后吸出孢子悬液10倍稀释，孢子悬液制成含菌量≤104 cfu/mL。采用沙氏葡萄糖液体培养基实施白色念珠菌接种，培养后应用氯化钠溶液10倍递增稀释，菌悬液制成含菌量≤104 cfu/mL。

取5份9.9 mL供试液，分别加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌，分别为0.1 mL混匀，抽取1 mL置入到无菌平皿中，置于胰酪大豆胨琼脂培养基中，温度≤45℃，平行制备2个平皿。

取2份9.9 mL供试液，分别加入黑曲霉菌、白色念珠菌试验菌菌液，分别为0.1 mL，取1 mL置入到无菌平皿中，置于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，温度≤45℃，平行制备2个平皿。

对照组应用供试液与稀释液混合后实施各项操作。

试验组平均菌落数与供试品对照组平均菌落数之差，同菌液对照组平均菌落数的比值为菌回收率，见表1。

表1 计数方法适用性试验回收率

2.2 控制菌检查法适用性试验

取供试液（供试品）与100 mL胰酪大豆胨液体培养基实施接种，分别放置1 mL大肠埃希菌菌液、乙型副伤寒沙门菌菌液；取供试液（供试品）与100 mL10 mL肠道菌增菌液体培养基实施接种，分别放置1 mL大肠埃希菌菌液、铜绿假单胞菌菌液。阴性对照试验通过稀释液予以检验，见表2。

表2 控制菌检查法适用性试验情况

3 讨 论

企业提供的牛黄上清丸经过检验可知，牛黄上清丸（大蜜丸）抑菌性欠佳，在培养基稀释法检验方式，能够降低其抗菌活性、药渣对菌落计数结果所产生的影响。对比《中国药典》2015版与2010版试验方法，可知2010版方法并不会因为2015版方法改变而完全废弃，它可作为探索新方法的参考，虽然2010版方法不能真实的反映药品对菌液的抑制能力，但是它也客观的体现出药品是否具有抑菌性、抑菌能力的强弱。