胃癌患者围手术期循环肿瘤细胞变化及其与临床病理分期的相关性

葛海燕， 张振宇， 茅丽玲， 纪 昉， 朱 哲， 高 玮， 付正伟

(1. 同济大学附属东方医院胃肠肛肠外科，上海 200120； 2. 浙江省平湖市第二人民医院，浙江 平湖 314200； 3. 上海市嘉定区南翔镇社区卫生服务中心，上海 201802)

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，而且大多数胃癌患者在首次诊断时就属于进展期胃癌，这些患者虽然接受了根治性手术和化疗等综合治疗，但仍然存在较高的肿瘤复发或者远处转移的风险，导致这些患者的预后差，5年生存率低。如何尽早发现胃癌，预判肿瘤病理分期，对提高胃癌患者的远期生存率有重要意义。

肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells， CTCs)近年来受到普遍关注[1]。由于CTCs可能具有生物学活性和转移潜能，近年来对于CTCs与临床肿瘤病理之间的相关性问题，引起了广泛的重视。一些研究者认为，通过检测肿瘤患者外周血中CTCs的数量，可以为判断肿瘤的临床病理分期和预后提供客观的依据[2]。本研究检测了92例胃癌患者术前、术后1周的外周血中CTCs的变化，并且将CTCs检测结果与其肿瘤病理分期进行相关性分析，探讨胃癌患者外周血中CTCs与肿瘤病理分期之间的联系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

将同济大学附属东方医院自2015年6月—2018年12月收治的胃癌患者纳入本研究。纳入标准： (1) 年龄不限；(2) 经胃镜检查和活组织病理学检查明确诊断为胃癌；(3) 患者入组前未接受任何化学药物、放射、免疫制剂、中医中药等治疗。以胃部良性疾病(慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃息肉)患者作为对照组。患者签署知情同意书，研究方案经过医院伦理委员会审核同意[(2016)研审第(056)号]。

1.2 CTCs检测

分别于手术前1天、术后第7天清晨抽取肘正中静脉血5mL，用EDTA抗凝管收集保存；裂解红细胞后，使用微流控芯片进行液体处理和CTCs捕获，利用anti-CD45抗体荧光染色白细胞，DAPI染色细胞核，CEP8(8号染色体探针)荧光原位杂交(FISH)染色体呈现异倍体(2倍以上)细胞，荧光显微镜下观察，并计数目标细胞。

1.3 CTCs判断标准[1-2]

(1) 光镜下有完整的细胞核，细胞呈圆形、椭圆形或长形；(2) 荧光下细胞形态及边缘完整，CD45(抗白细胞表面抗原)阴性；(3) 细胞核DAPI核染色阳性,细胞核直径大于8μm，并且核形状不规则；(4) CEP8>两个信号点；(5) 同一个标本中符合上述标准的细胞≥2个视为CTCs阳性。

1.4 胃癌患者资料收集

记录胃癌患者手术后的病理检查资料，包括肿瘤细胞的浸润深度、淋巴结转移数量、神经侵犯、脉管浸润、TNM分期等信息，并进行胃癌患者CTCs与肿瘤浸润深度、肿瘤分化、淋巴结转移数量、TNM分期等相关性分析。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 一般资料

列入本研究的胃癌患者共92例(男性56例，女性36例)，年龄分别为32～82岁，平均年龄(65.3±12.6)岁。手术前1天从患者外周血中检出CTCs阳性58例，阳性率63%。CTCs阳性的鉴别标准为DAP1染色(+)、CEP8染色(+)、CD45染色(-)，见图1。

图1 CTCs阳性的鉴别标准Fig.1 The criteria for identifying positive CTCs主机： Leica DM3000；软件版本： Leica Application Suite Version 4.9.0；放大倍数×400；A： DAPI标记阳性细胞；B： CEP8标记阳性细胞；C： CD45阴性细胞；D： 将三者叠加的效果图，具备DAP1(+)CEP8(+)CD45(-)特征的细胞为CTCs

2.2 胃癌患者外周血CTCs与临床病理之间的相关性

92例胃癌患者手术前的外周血CTCs检测结果以及与性别、年龄、肿瘤浸润深度、TNM分期、神经侵犯、脉管侵犯等主要临床病理资料的统计分析结果见表1。结果显示，胃癌患者外周血中CTCs的阳性率与他们的年龄、性别没有相关性(P>0.05)，但是，胃癌患者CTCs的阳性率与肿瘤浸润深度、TNM分期、神经与脉管侵犯的差异都具有统计学意义(P<0.05)。在肿瘤的浸润深度和TNM分期方面，不同组别之间差异也有统计学意义(P<0.05)，随着肿瘤侵犯深度的加深，外周血中循环肿瘤细胞的阳性率也随之增加，患者中具有脉管侵犯的CTCs阳性率显著高于没有脉管侵犯者(P<0.05)。

表1 CTCs阳性率与患者的性别、年龄，肿瘤的 T分期、TNM分期及神经、脉管侵犯的相关性

2.3 肿瘤不同浸润程度对CTCs的影响

将肿瘤组织不同浸润深度的病例进行分组，将肿瘤分期为T1、T2分为一组，肿瘤分期为T3、T4分为一组。从表2可以看到浸润程度深的患者，CTCs阳性率显著高于浸润深度浅的患者(P<0.05)。

表2 胃癌患者不同T分期与CTCs阳性率的比较

2.4 手术前后胃癌患者CTCs阳性率的变化

86例患者在术后1周进行了CTCs检测，占93.5%，其余患者由于提前出院、标本保存等因素，未能检测。手术前CTCs阳性的58例胃癌患者术后1周的检测结果： CTCs数量减少或者归零者35例，占60.3%；CTCs数量无变化者15例，占25.9%；CTCs数量增加者8例，占13.8%。这些结果表明，胃癌根治术后短期内就能够有效减少患者的CTCs负荷，获益人群达到60%左右。但是还有近26%的患者CTCs并没有减少，甚至少部分患者(占13.8%)术后CTCs反而升高。分析这部分患者的临床病理资料，发现术后CTCs没有减少甚至是增加者，主要是TNM分期较晚(Ⅲ、Ⅳ期)患者，伴有血管内癌栓、周围组织癌结节和腹膜癌结节形成等晚期现象，见表3。

表3 58例胃癌患者术后CTCs变化与临床病理的关系

3 讨 论

实体癌的微转移是肿瘤恶性特征的重要表现之一，与肿瘤的临床病理分期、转移与复发、预后具有十分紧密的关系[3-4]。

CTCs检测是近年来兴起的一项临床新技术，通过对外周血中CTCs的分离富集以及对CTCs的检测等步骤，直接检测外周循环血液中肿瘤细胞的存在与否[5]。因此，文献报道在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌等等多种实体瘤患者的外周血中都能检测到CTCs，并且CTCs的恶性度与原发肿瘤细胞大致相同[6-8]。一些研究表明，CTCs的存在与肿瘤分期具有明显的相关性，CTCs数量越多，患者面临远处转移的肿瘤细胞负荷越重，未来发生转移的可能性就越大[9-10]。外周血中的异倍体细胞被认为是CTCs的标志之一[2]。

从本研究结果可以看出，胃癌患者的外周血中确实能够检测到CTCs，阳性率为63%，与文献报道基本相同。田晓坤等[10]报道在41例胃癌患者外周血中，有29例CTCs检测结果为阳性，阳性率为70.7%。本研究结果还表明，胃癌患者外周血中CTCs的阳性率与临床肿瘤病理分期具有相关性，分期越晚，CTCs阳性率越高，而早期患者的CTCs阳性率很低。但是也有文献报道，胃癌患者外周血中CTCs阳性率与肿瘤的分期、分化程度和淋巴结转移均无明显相关性[9]。因此，对于胃癌患者外周血中CTCs阳性率与临床肿瘤病理的联系，值得在更大范围，纳入更多病例进一步深入研究。

对于胃癌根治性手术后CTCs的变化，目前文献仍然报道很少。本次初步观察结果表明，多数患者在行胃癌根治性手术后，CTCs转阴或者减少(60.5%)，反映随着原发肿瘤的切除，外周血中CTCs也随之减少或消失，表明了手术的根治性与彻底性。但是，仍有总数近25.9%的患者CTCs没有明显变化，13.8%的患者CTCs数量还有所增加，并且与其TNM分期晚(Ⅲ、Ⅳ)密切相关。这些现象提示： (1) 对于病理分期晚的胃癌患者，单纯的手术切除并不能消除所有的CTCs，需要联合术后化疗等综合治疗措施，以完善治疗方案；(2) 对于胃癌根治术后CTCs仍然阳性的患者，观察术后1周还是不够的，需要增加术后2、4周等节点的检测，以便能够更加全面地了解手术后CTCs的变化规律；(3) 目 前的CTCs检测技术还不能完全反映外周血中肿瘤细胞的状况，由于CTCs的数量极少，不可能在外周血中形成均匀分布，随机的单次采血检测，就大大增加了捕捉CTCs的难度和偶然性。因此，研究团队认为即使CTCs检测阴性，也并不能代表外周血中没有CTCs。今后可以考虑联合应用microRNAs检测等技术[11]，进一步丰富外周血中肿瘤信号的检测。

志谢在本研究实施过程中，得到宁波美晶医疗技术有限公司的技术支持，在此深表谢意！