精液稀释液的配制及检测

吴德标

（江苏省盐城市盐都区家畜改良站，江苏 盐城 224056）

猪精液稀释液的质量关系到猪精子的体外存活时间。在授精环节中猪精液稀释液的配制、消毒及检测工作都影响着授精效果。

1 配方与药品

葡萄糖—柠檬酸钠液是一种较简单的稀释液配方。配置稀释液的药物原料要纯净，尽可能选用化学纯和分析纯制剂。

1.1 葡萄糖 葡萄糖补充精子代谢过程中消耗的能量。精子代谢是单纯的分解作用，只能利用简单的能量物质，葡萄糖即是其中之一。配制精液稀释液以用注射用葡萄糖为好，比例占5%～6%。

1.2 柠檬酸钠 柠檬酸钠是缓冲物质，用于维持精液相对恒定的pH 值，避免精子代谢产物影响精液品质。市售品有柠檬酸三钠或枸橼酸钠，本品用量较小，以用分析纯为好，比例占0.3%～0.5%。

1.3 乙二胺四乙酸二钠 本品有保护精子抗冷休克的作用，能改变精子细胞膜的通透力，降低精子的果糖分解，抑制精子的活动，延长精子的寿命，同时它也是一种螯合剂，可使精液稀释液所含不利于精子存活的一些金属离子变成稳定的络合物，减少对精子的伤害。本品以用分析纯为好，比例占0.1%。

1.4 水 宜用纯净、新鲜的蒸馏水，水质决定稀释液的质量。蒸馏水可自制，要符合药典标准。

1.5 抗生素 精液难免被细菌等有害微生物污染，因此稀释时须加入抗菌物质抑制有害微生物生长繁殖。实践证明庆大霉素能抑制细菌，且对精子无伤害，用量为1万国际单位/100 mL。

2 药物称量和溶解

配置稀释液用天平称取药品，用量杯量取水。需注意的是称、量一定要准确，所有药品必须充分溶解，特别是乙二胺四乙酸二钠和柠檬酸钠等较难溶解的药品。

配制分两步进行，第一步将所称药品放入锥形瓶内，加入适量蒸馏水后加热使之充分溶解；第二步再加入蒸馏水定容到所需量，并充分搅拌。配置好的稀释液须过滤掉所有杂质。

3 稀释液消毒

稀释液是一种培养基，配置好的稀释液必须严格灭菌，可采用高压消毒锅对稀释液进行消毒灭菌。

灭菌时将稀释液装入500 mL洁净的盐水瓶，塞上瓶塞并用纱布包裹扎紧，再放入锅内，盖上锅盖，拧紧环状压盖螺帽，关闭放气阀，接通电源加热。当压力升到0.3 kg/cm2时打开放气阀，放出高压锅内冷气，让指针回落到零位，然后再关闭放气阀，继续加热。当压力重新上升到0.7 kg/cm2时，锅内温度已达到115 ℃，可控制电源开关维持锅内的压力和温度，使恒温恒压维持半小时，然后打开放气阀缓慢放气，使指针回落到零位，最后打开锅盖，取出稀释液冷却备用。

4 稀释液检测

消毒稀释液检测合格后方能使用。检测方法有二种：

4.1 pH 值测定 稀释液pH 值的变化对精子的活力和代谢有很大影响。18～20 ℃条件下，pH值为6.4 的精子处于可逆的“休眠”状态，所以稀释液的pH值宜在6.4～6.5之间。

稀释液pH值应在稀释液消毒后温度降至室温时测定。可用pH 6～8的精密试纸测定稀释液pH值，稀释液滴在试纸上半秒钟内与标准比色板比较，得出pH值。有条件的可用酸度计测定，用酸度计测定时要注意校正温度并正确进行酸度计的标定，以免引起误差。

4.2 渗透压测定 通常要求稀释液与精液保持等渗，渗透异常会影响精子的代谢和活力，低渗比高渗的危害大。

用贝克曼温度计（示差温度计）来测定稀释液的冰点下降度（△t），再除以常数1.86，计算出克分子浓度（即渗透压）。纯水在0 ℃开始结冰，0 ℃是纯水的冰点，但水中溶有其他物质时，其在0 ℃以下的某个温度开始结冰，随溶质浓度升高，结冰的温度逐步降低，纯水冰点与溶液冰点的差为冰点下降度，常用“△t”表示。

用贝克曼温度计测定猪精液稀释液渗透压的操作步骤如下：

4.2.1 器材准备 需准备的器材有贝克曼温度计，滴定台，1 000 mL 量杯，冰若干，粗盐若干，铁丝圈，20×15试管若干支。

4.2.2 温度计调整 贝克曼温度计是长56 cm 的玻璃管制成的，玻璃内部上下各有一个水银泡，中间有0～5 的刻度，每一刻度又分成100 等份，上端水银泡为—U状细管，内有贮备水银，通过球状阀与下端水银泡相通，以便调节下端水银泡水银的多少。

调整时手握温度计，使温度计倾斜呈倒置状态，同时转动温度计，使U型管中的水银与温度计顶端的球形阀相接，然后另一手握住下端水银泡（温度计处于倒置状态，此时下端水银泡在上方），借助手温使水银柱上升并通过球形阀与U型管中的贮备水银接通。水银的多少调节好后，左手握温度计的上部，右手中指轻击温度计，使U型管中的水银与球状阀连接点断开。

4.2.3 温度计安装 温度计调整好后固定在滴定架上。温度计的下方装有一个可以上下移动的1 000 mL量杯，量杯中放置冰块，冰块上撒些粗盐，将20×15试管置于冰块中待用。

4.2.4 测定纯水冰点 试管中加入待测的蒸馏水，水量以能浸没温度计下端水银泡为度。将铁丝圈放入试管中，并将温度计下端水银泡插入试管的水中浸没。随后用铁丝圈上下搅动试管中的蒸馏水，使温度均匀下降。

溶液结冰的瞬间会释放出能量，因此，当试管中的水开始结冰时，水银柱会停止下降而突然上升。水银柱停留在某一刻度不再上升时，读取的数值即为纯水的冰点。

贝克曼温度计上的刻度不是实际温度，而是所测溶液冰点的相对刻度值（即贝克曼温度计零点），而其零点与下端水银泡中的水银多少有关，所以每进行一批次测定都要重新调整温度计。连续测定三次纯水冰点，读数末位之差不超过3时，取其平均值，超过3时应重做。

4.2.5 测定精液与稀释液 测得纯水冰点后，进行稀释液（或精液）的测定，测定方法同上。测定完毕取出贝克曼温度计时，往往试管中的溶液已结冰，此时要待冰融化后再将温度计取出，切勿硬拉。每测完一种溶液后，需将温度计下端擦拭干净，所用试管应先用被测溶液冲洗一下，以免影响测定结果。贝克曼温度计使用完毕，应擦拭干净并倒置，使下端水银泡中的水银向U型管中回流一些，然后置盒中保存。

4.2.6 计算冰点下降度 纯水三次冰点平均值：t，所测溶液三次冰点平均值：t′，冰点下降度△t＝t-t′。