在药物分析中采取固相表面荧光光谱法的研究

赵森铭

(洛阳市食品药品检验所,河南 洛阳 471008)

最早固相表面荧光分析技术是在三硝基甲苯的定量分析中得到应用，随着研究的逐渐深入，这一方法逐渐在其他领域比如生物大分子、气体检测、有机污染物分析、药物分析、无机离子分析等得到广泛应用[1]。因为是直接于固体基质表面开展固相表面荧光的分析检测,所以利用固相载体就能够直接联合其他分离技术,因此能够完成富集目标组分、复杂样品基体的分离，这样可以使测定获得更高的灵敏度，确保能够实现分析检测痕量、微量组分[2]。近些年研究逐渐发现固相表面荧光分析法能够提供痕量药物及其残留检测的定量信息，其具体可以应用的检测方法包括流动系统基础上的在线固相表面荧光分析、直接固相表面荧光分析法、联合应用固相萃取分离富集与固相表面荧光分析，本文具体进行分析。

1 在线固相表面荧光分析法

1.1 流动注射－固相表面荧光法 研究选择KCL溶液当作载流以及固相基质材料的再生试剂,完成了单一流路流动注射－固相表面荧光奎尼丁、奎宁分析法的建立。控制进样为40μl，能够准确定量分析10～650μg/L 的奎宁,进样频率为 33/h,10～500 μg/L的奎尼丁,进样频率为40/h[3]。

如果是非荧光性药物分子,通过荧光衍生法对固相表面荧光实施分析检测，通常情况下，流动注射进样分析更有利于在线衍生操作的顺利开展。于流动注射－固相表面荧光分析系统中引入进光反应器，通过紫外光对维生素B1实施照射，促使其在线完成向具备强荧光性的光化学产物的转化,得到的产物可以在流通池内填充的C18硅胶上吸附保留,所以能够完成固相表面荧光检测维生素B1[4]。根据其完成的分析方法对目标分析物的选择性非常强，能够在共同具备其他维生素B复合物的基础上快速测定维生素B1。

1.2 联合应用固相表面荧光法 联合应用固相表面荧光法可更新表面技术,假设将固相表面荧光检测、流动注射方法联合起来使用，或者将固相表面荧光检测法、顺序注射方法联合起来使用,这样即便流通池中填充的固相基质可以进行循环再利用,但实际上大多数情况下进行很多次次吸附操作后，或者多次洗脱操作后，固相基质表面会出现污染表现,甚至会出现有效功能团以及活性位点损失的情况,因而会使得载体表面吸附性能出现变化，洗脱性能也会出现变化,分析性能会由此下降[5]。而通过更新表面技术,这一问题得到了有效解决,这一技术是在每次分析结束后在废液中排入使用过的固相基质材料,下一次进行分析时,反应器填充新的固相基质材料,这样仅仅需要更新固相基质填充材料就能够保证较高可靠性，确保检测的精密度以及准确度[6]。

1.3 顺序注射－固相表面荧光法 蠕动泵可以选择注射泵代替，完成液流输送，同时因为液流双向驱动模式能够程序化控制，所以设计流路更为简单，也能更加灵活。在具体应用中，建议在不同模式的液流操控中选择某一个固定的流路装置,这样能够同时检测不同组分。仅仅需要在适当时候将精确控制的样品区带、试剂引入后进行测定和分析，连续载流无需试剂的使用。因而该法针对长时间连续检测更为适用,同时能够显著降低样品消耗量以及试剂消耗量[7]。固相表面荧光检测的基质材料选择C18键合硅胶,固相表面化学发光检测载体选择Sephadex QAE A-25树脂，在不同检测流通池中相应导入维生素B2、B6、C的样品溶液,能够完成分离不同种维生素组分,固相荧光/化学发光组在线合检测,三者的检出限相应是0.12mg/L、0.008mg/L、9.10mg/L。

表1 药物分析中在线固相表面荧光分析法的分析性能

2 直接固相表面荧光法

这一方法具体是在固体基质上点加药物样品溶液，等到其完全干燥之后，直接于荧光仪上对固相基质表面残留的目标组分的荧光光谱给予测定，实施定性、定量分析[8]。固相表面荧光的基质材料有多种选择，包括聚氯乙烯颗粒、硅胶、纤维素、氧化铝、滤纸等[9]。这一方法最大的特点在于需要用到的样品量少，操作难度小，能够明显减少分析所需花费,对于快速筛查或检测大批量样品非常适用。研究显示，处于醋酸钠、C18硅胶、硅胶、纤维素表面时，卡巴咪嗪不会有荧光表现，如果处于尼龙膜表面，则会有强荧光发射，主要是由于其具备一样的胺基基团[10]。根据这一表现进行固相表面荧光分析法的建立能够分析测定药物制剂中、血清样品中微量卡巴咪嗪，仅需要消耗7μl样品量。

3 联用固相萃取分离富集、固相表面荧光法

以往固相萃取具体是洗脱后进一步开展定性或定量分析,但是其容易出现固相基质表面目标药物无法完全洗脱的问题，影响结果准确性，另外引入大量洗脱剂会降解药物组分,同时洗脱剂导致的溶剂效应会改变药物分子结构,影响结果准确性[11]。而选择联合应用固相萃取与固相表面荧光检测能够防止防止溶剂引入洗脱目标组分,能够直接荧光检测聚集在吸附剂表面的药物组分,因此有助于样品损失量降低，防止出现溶剂效应，并且有助于结果准确性的提升[12]。

考虑到溶液环境中荧光强度较弱,针对部分弱荧光性药物分子,不可以在常规荧光方法下进行检测。选择固相表面荧光技术、固相萃取分离富集两种方法联合应用能够解决这一问题，固相萃取－固相表面荧光法、溶液荧光法能够同时检测强荧光性速尿灵、弱荧光性阿米络利。选择尼龙膜当作操作中的固相基质材料，尼龙膜能够富集阿米络利，滤液中速尿灵保留下来,尼龙膜上吸附存在的阿米络利分子刚性、荧光发射强度明显增加，通过固相表面荧光法能够实施直接的检测，相比之下，溶液中相同浓度的阿米络利几乎没有荧光发射峰,见图1、图2。根据这一结果建立起来的分析法对阿米络利的富集倍率为1500倍,检出限在0.1 μg/L以下,对于分析测定痕量阿米络利非常适用。

图1 尼龙膜上阿米络利（0.8mg/L）激发a和发射b光谱，尼龙膜的荧光发射背景c，阿米络利溶液（0.8mg/l）的激发d和发射e光谱

针对不同药物分子之间、药物分子与基体之间存在的荧光广谱重叠问题,借助固相萃取的选择性分离这一机制也能够有效解决。通过荧光法对血清中吡罗昔康进行测定,血清基体的荧光发射对吡罗昔康的荧光光谱形成影响,且影响较大[13]。通过C18固相萃取膜借助C18键以及硅胶的疏水性能够使吡罗昔康样品溶液选择性保留非极性吡罗昔康，同时能够分离于基质，进而能够通过固相表面荧光法对C18表面保留的吡罗昔康进行检测。

图2 固相表面荧光检测系统固体支架示意图

4 讨论

采用固相表面荧光法进行药物分析,能直接测定固体样品,具有广阔的应用前景,建议推广使用。要想顺利实施固相表面荧光分析,或者选择两种技术进行联合分析,必须确定适合的固相基质材料，尼龙膜、葡聚糖凝胶、硅胶等一直是当前应用比较广泛的基质材料,但是其仅能够用于对有限的药物组分进行分析[14]。所以在往后的研究中，应该注重研究开发更多新型的材料,这些材料不仅应该有较高的合成光学透明度,还应该能够选择性吸附药物。通过化学改进、表面修饰等技术的应用，促使基质材料吸附选择性逐渐提升,将其荧光背景减弱,因而药物分析中固相表面荧光应用范围会得以提升。

固相填充材料选择合理除了能够富集部分特定目标组分，还能够分离与检测多元目标组分，特别针对简单二元混合物体系，无需色谱分离，通过简单的固相表面荧光检测装置就可以分离、检测以及富集。对于现代药物分析工作，样品基体的要求逐渐复杂多样,所以固相表面荧光分析法也应该注重结合其他分析技术包括增敏、衍生、分离以及富集,形成具备灵活性以及多样性的在线分析模式,能够快速检测复杂基体样品中存在的不同种药物组分，使其可以一起完成测定。