威代尔冰葡萄酒挥发性成分的全二维气相色谱/飞行时间质谱分析

黄 玲 ，李记明 ，李兰晓 ，徐 岩 ，唐 柯 *

（1. 江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡，214122；2. 张裕葡萄酿酒股份有限公司 研发中心，山东 烟台，264000）

冰葡萄酒是利用-8℃的气温下，在葡萄架上自然冰冻的葡萄酿造而成的葡萄酒 （Vintners Quality Alliance，VQA），其独特的酿造工艺使其与普通葡萄酒在风味特征上具有较大差异。 中国桓仁地区因其具备酿造冰葡萄酒的典型的气候特征，现在已经成为世界上重要的冰葡萄酒生产地之一。 随着中国冰葡萄酒市场的逐渐扩大，冰葡萄酒也越来越受到广大消费者的欢迎[1]。 然而中国冰葡萄酒尚存在风格特点不明确的问题，并且在品质上较世界主要冰酒产国（加拿大、德国等）生产的冰葡萄酒还有待改善[2]，而解析和确定冰葡萄酒中的香气成分是实现冰葡萄酒风味调控、提高冰葡萄酒品质的首要问题。

近年来，葡萄酒中挥发性成分的检测分析主要基于一维气相色谱[3]。 李艳霞等[4]采用顶空固相微萃取结合气相色谱及质谱联用对威代尔冰葡萄酒中的香气成分进行了分析，分离并定性了其中的59种香气化合物，主要为酯类、醇类、酸类和呋喃类化合物。 随后，王玉峰等[5]、秦绍智等[6]、王蓓等[7]分别采用溶剂萃取法结合气-质联用、液液萃取结合气-质联用以及搅拌棒吸附萃取结合气-质联用等方法对不同葡萄品种冰葡萄酒（包括赤霞珠、威代尔及雷司令冰葡萄酒）中主要香气成分进行了分析。 在气-质联用的基础上，马玥等[8]进一步采用固相萃取结合嗅闻 （gas chromatography-olfactometry，GC-O）对威代尔冰葡萄酒中具有重要贡献的香气化合物展开了研究，并在威代尔冰酒中检测出对冰酒香气有重要贡献的3-甲硫基丙醛及菠萝酮等之前未报道过的冰葡萄酒中重要的香气活性物质[9]。 这些研究丰富了对冰葡萄酒中香气化学成分的认识并对冰葡萄酒风味轮廓的解析奠定了基础。

然而，常规的一维气相色谱经常出现样品中色谱峰重叠的现象并影响定性结果的准确性。 相对于一维气相色谱，全二维气相色谱具有更高的分辨率、灵敏度以及峰容量，已广泛用于复杂体系样品的分离分析[10]。 国外已经将全二维气相色谱大量的用于酒精饮料（如葡萄酒[11]、伏特加[12]、啤酒[13]、利口酒[14]等）、奶制品[15]、茶[26]等的风味成分的剖析，而国内也已有应用于白酒[17]、露酒[18]、醋[19]、中药[20]、龙井茶[21]等挥发性成分分析的报道。 但目前利用全二维气相色谱对冰葡萄酒的研究还鲜有报道。 因此作者采用全二维气相色谱-飞行时间质谱法（comprehensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC × GC-TOFMS）对冰葡萄酒中挥发性成分进行鉴定，这不仅为后续深入研究冰葡萄酒挥发性风味轮廓的化学组成及香气呈香机理提供了技术支撑，也为进一步改善冰葡萄酒品质提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

威代尔冰葡萄酒：烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司产品；C5-C30 正构烷烃：天津光复精细化工研究所产品。

1.2 仪器与设备

全二维气相色谱-飞行时间质谱系统（Agilent 7890N 气相色谱）：美国 Agilent 公司产品；KT-2001冷喷调制器：美国Zoex 公司产品；Pegasus 4D 飞行时间质谱仪：美国Leco 公司产品。

2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 三相萃取头、固相微萃取装置：美国Supelco 公司产品；B11-2 型恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司产品；B150/7.5 × 15 mm 磁力搅拌子：山东新华公司产品；电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品。

1.3 方法

顶空固相微萃取[9，17]：取 8 mL 冰葡萄酒样品置于20 mL 顶空样品瓶中，加入3 g 氯化钠及搅拌子。萃取温度50 ℃，样品平衡5 min，萃取45 min，转速250 r/min。萃取结束后进样，将萃取头置于GC 进样口（250 ℃）解析附 5 min。

气相色谱条件：色谱柱：一维色谱柱DB-FFAP（60 m × 0.25 mm ID，0.25 μm），二维色谱柱 Rxi-17Sil MS（1.1 m × 0.25mm ID，0.25 μm）。 色谱条件：进样口温度250 ℃，以不分流模式进样。 一维柱温箱升温程序：起始温度 45 ℃保持 2 min，以 4 ℃/min 的速率升温至230 ℃并保持15 min。 调制器调制时间4 s，热调制时间为 1 s，调制补偿温度为 20 ℃。 二维柱温箱升温程序：起始温度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升温至250 ℃并保持5 min。以高纯氦气作为载气，恒流模式，流量：1 mL/min。

飞行时间质谱条件：采用EI 离子源，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃，电压控制70 eV。检测器采集质量数范围35～400，采集频率100 spectrum/s，电压控制1 430 V。 数据由LECO 公司Pegasus 4D工作站采集。

数据处理：利用仪器自带ChormaTOF 软件对采集的数据进行解析，色谱峰的峰宽分别设为24 s 和0.2 s，自动识别信噪比大于200 的色谱峰后进行自动积分解卷积和质谱库（mainlib，Wiley 9 和replib）比对，进一步通过保留指数（保留指数根据C5-C30计算得出）定性并剔除烷烃类等无明显风味贡献及胺类等主要呈味的化合物，选择相似度及反相似度不小于800 的化合物作为最终鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 威代尔冰葡萄酒挥发性成分定性分析

基于全二维气相色谱与飞行时间质谱联用的方法，共在威代尔冰葡萄酒中检测到953 个色谱峰，如图1 所示。

图1 威代尔冰葡萄酒GC × GC-TOFMS 分析一维及二维总离子流图Fig. 1 GC × GC -TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of Vidal icewine

通过Pegasus 4D 工作站对质谱库的检索结合保留指数比对，共定性了其中的253 种香气化合物，其中包括酯类53 种，醇类40 种，芳香族化合物39 种，萜烯类 35 种，醛酮类 25 种，呋喃类 21 种，酸类12 种，硫化物9 种，内酯类9 种，其他杂环化合物 10 种（图 2）。 相较于一维 GC-MS 对冰葡萄酒香气的分析[4-9，22]，GC × GC-TOFMS 表现出更好的分离效果。 例如，在威代尔冰葡萄酒中检测到的2-糠酸乙酯、β-环柠檬醛和γ-戊内酯一维出峰时间均为1696 s，但在二维上（出峰时间分别为 8.4、15.1 s 和17.9 s）能够很好的分离得到3 个单独的色谱峰。

图2 威代尔冰葡萄酒鉴定出化合物种类及数目Fig. 2 Classification of volatile compounds qualified in Vidal icewine

在鉴定出的挥发性成分中，酯类、醇类及芳香族化合物占所有化合物的52%。 酯类在葡萄酒中主要呈果香，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯等呈香蕉菠萝等热带水果的香气。 除饱和脂肪链酯类外，还检测到丙烯酸丁酯、2-己烯酸乙酯、9-癸稀酸乙酯等不饱和脂肪酸酯。 醇类也是葡萄酒中重要的风味化合物，如顺-3-己烯醇通常表现出青草的清香。 芳香族中苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等均在葡萄酒中表现出花香，同时检出的百里香酚、愈疮木酚、4-乙基愈疮木酚、 丁香酚等可提供烟熏烟草的香气。

萜烯类化合物主要来源于用于酿酒的葡萄中，是葡萄酒一类香气品种香的重要组成[23]。 作者共检测到35 中萜烯类化合物（表1）。 王蓓等[7]利用搅拌棒吸附萃取结合一维气-质联用在威代尔冰葡萄酒中检测到24 种萜烯类化合物Ma 等[9]通过GC-OMS 在威代尔冰葡萄酒中共检测到11 种萜烯。 作者鉴定出的 3-p-薄荷烯、 月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-罗勒烯、 胡椒酮、cis-冬青油醇等化合物均未在基于一维气-质威代尔冰葡萄酒挥发性成分检测中有过相关报道。 3-p-薄荷烯、胡椒酮在葡萄酒中主要呈现薄荷的清香，月桂烯呈天竺葵和药香，水芹烯呈水果和薄荷的香气[24]，但这些香气化合物在冰葡萄酒中的风味贡献有待进一步研究。 β-大马酮、玫瑰醚分别呈蜂蜜和花香，在冰葡萄酒模拟液中阈值分别为 1.05 μg/L、0.09 μg/L[25]，这两种化合物被报道对冰葡萄酒香气具有重要贡献[8-9]。 TDN（1，1，6-三甲基-1，2-二氢萘）在葡萄酒中呈现汽油味，是雷司令葡萄酒中的典型香气特征，王蓓等[7]关于威代尔冰葡萄酒香气成分的分析中也曾检测到该化合物。

含硫化合物其低阈值及独特的香气特征使其成为现今食品风味研究的一个热点。 大多数的挥发性硫化物被认为是异嗅化合物，但也有部分硫化物对食品的风味特征具有重要作用。 据报道，糠硫醇是芝麻香型白酒中呈现其独特芝麻香气的关键化合物[17]。目前冰葡萄酒中关于硫化物的报道还较少，本研究在威代尔冰葡萄酒中检测到了9 种硫化物，分别是二甲基硫、甲硫醇、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙醛、2-噻吩甲醛、4-甲基-5-乙烯基噻唑、2-甲硫基乙酸乙酯、 顺-2-甲基-4-丙基-1，3-氧硫杂环己烷、3-乙硫基丙醇。 其中3-甲硫基丙醛在冰葡萄酒中主要表现为煮土豆的香气特征，并且对冰葡萄酒整体香气感知具有显著影响[9]。 二甲基硫表现为白菜、芦笋、玉米和糖浆的香气。 这些硫化物在冰葡萄酒中的具体贡献和作用目前还并不明晰，是否对冰葡萄酒的香气起修饰作用或是增加冰葡萄酒的复杂性，这些问题均有待进一步研究。

表1 威代尔冰葡萄酒中的萜烯类化合物Table 1 Terpenes in Vidal icewine

续表1

2.2 威代尔冰葡萄酒挥发性成分相对含量

根据定性出的化合物的出峰时间及峰面积绘制气泡图（图3），气泡的大小表示峰面积的大小，由图可知，酯、醇、酸、芳香族化合物峰面积较高，而大多数呋喃、醛酮、内酯、硫化物、萜烯等峰面积均较低。 其中相对含量（峰面积占总化合物峰面积比例）高于 0.5%的化合物有 31 种 （表 2），包括乙酸、己酸、异丁醇、正己醇、1-丁醇、1-丙醇、1-辛烯-3-醇、1-戊醇、3-辛醇、1，2-丙二醇、顺-3-己烯醇、2，3-丁二醇、1-庚醇、乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、糠醛、乙醛、3-羟基-2-丁酮、苯甲醛、2，4-二叔丁基苯酚、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、4-萜品醇、脱氢芳樟醇、橙花醇氧化物。 其大部分为酯类和醇类，还包括3 种萜烯化合物，这些化合物构成了冰葡萄酒挥发性组分的主体，可能为冰葡萄酒提供馥郁的果香、花香。 Ma 等[9]通过重组缺失实验发现菠萝酮和3-甲硫基丙醛对威代尔冰葡萄酒焦糖的香气具有重要影响，说明香气化合物对葡萄酒整体香气的贡献并不完全取决于其含量。 同时，萜烯、硫化物等痕量化合物具有较低的阈值，因此，进一步通过确定痕量化合物的含量并结合阈值等探究其对冰葡萄酒香气的贡献及价值，能够更全面深入的了解冰葡萄酒的风味轮廓。

图3 威代尔冰葡萄酒中挥发性化合物分布Fig. 3 Scatter plot of volitale compounds in Vidal icewine

表2 相对面积分数 （峰面积占化合物总峰面积比例） 高于0.5%的香气化合物Table 2 Aroma compounds in Vidal icewine with relative peak area over 0.5%

续表2

3 结 语

采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱法分析了威代尔冰葡萄酒挥发性成分，共定性了其中的253 种香气化合物，其中，共检测到35 种萜烯和9 种含硫化合物。 3-p-薄荷烯、月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-罗勒烯、胡椒酮、cis-冬青油醇等萜烯化合物均未在一维气-质威代尔冰葡萄酒挥发性成分检测中有过相关报道。 同时，对香气化合物相对含量进行了分析，其中相对面积分数（峰面积占总化合物峰面积比例）高于0.5%的香气化合物有31 种，这些化合物可能是形成冰葡萄酒香气的重要组成部分。 但由于香气化合物对葡萄酒风味的贡献不仅取决于化合物的含量，也受其阈值的影响。 一些低阈值的痕量化合物如萜烯、硫化物等也可能会对冰葡萄酒香气具有重要影响，因此这些化合物对冰葡萄酒香气的贡献有待结合精确的定量分析进行进一步的研究。