十字花科作物根肿病对根际土壤微生物群落的影响

伍文宪,黄小琴,张 蕾,杨潇湘,黎怀忠,刘 勇, *

1 四川省农业科学院植物保护研究所,农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室,成都 610066 2 成都市郫都区农业和林业局,成都 611730

十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)侵染引起的一种毁灭性土传病害[1],在世界范围内造成油菜和十字花科蔬菜严重的经济损失,在我国,根肿病的为害范围已经覆盖了所有十字花科作物的主栽区,危害程度逐年加重,根肿病已成为制约十字花科作物生产的主要病害之一[2- 3]。根肿病病原菌具生命力强(其休眠孢子在土壤中存活20年之久仍保持侵染能力)、侵染效率高(土壤中极低病原孢子浓度即可造成十字花科作物罹病)、传播途径多样(可随流水、农事操作等传播扩散)等特点,导致该病害菌源广泛传播、种群结构复杂、防治难度高[4- 5]。传统的根肿病防治方法主要集中于化学防治、抗病品种选育以及栽培措施上,在减轻根肿病发生上取得了一定成效,但也存在诸多弊端,例如育成的抗病品种在根肿病流行区连续种植3年以上即有丧失抗性的风险[6- 8]。近年来,人们寄希望土壤改良的农业措施和生物防治方法以达到有效防控根肿病流行发生的目的,如通过调节土壤pH、增加土壤有机质含量、施用恢复土壤微生物平衡的生防制剂来恶化根肿病原的生存环境,取得了不错的防病效果[9- 11],土壤微生态治理已然成为十字花科作物根肿病防治的主要途径之一[12]。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,参与并推动了生态环境中物质和能量的流动和转移[13],其群落结构组成与土壤健康状况有密切联系,是评价土壤质量的重要指标[14]。土传病害的爆发是土壤微生物特别是根际土壤微生物群落结构失衡的结果,病害的发生打破了植物-土壤-微生物相对稳定的生态系统,深刻影响着土壤微生态(土壤理化性质、微生物群落结构、土壤酶活等)环境[15]。近年来,我国作物土传病发病率不断上升,对此,土传病害发生与根际土壤微生物相应地成为研究热点之一[16- 17]。李金萍等[18]研究表明青稞根腐病显著改变根际土壤微生物组成,碳、氮、磷等物质代谢受到抑制,并且能量代谢发生紊乱。陆晓菊等[19]在研究三七根际土壤微生物区系遗传多样性中发现,土传病害的发生与土壤理化性质和土壤微生物的种群结构及其优势微生物的种群比例具有密切的关联性。Shen等[20]研究显示香蕉枯萎病的发生与土壤微生物群落结构和土壤有机质含量紧密相关。目前,针对十字花科作物根肿病对寄主根际土壤微生物群落影响的研究尚无人报道,本研究以罹病大白菜和健康株根际土壤为研究对象,采用高通量测序技术结合生物信息学技术分析2组样本间的根际土壤细菌和真菌物种组成、群落结构及多样性,同时测定根肿病对根际土壤理化性质影响,旨在分析根肿病、微生物群落以及土壤理化性质三者间的相关性,通过研究根际土壤中微生物群落的结构差异,探究土壤中制约根肿病发生的关键因素,为揭示根肿病发生的根际微生态机制以及研发根肿病综合防控技术提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 研究区概况、土壤采集和理化性质测定

研究区位于成都平原腹心地带的郫都区唐昌镇柏木村,地理坐标为30°54′56.61″N,103°48′32.43″ E,海拔(574±20) m,属亚热带季风性湿润气候,年平均气温16℃,无霜期大于340 d,降水集中于7—8月,年均降水量979.4 mm,平均相对湿度为82%,年日照率仅24%—32%,日照1014.0 h。土壤类型灰色潮土性水稻土,土地垦殖指数高,土壤采集样地的周年种植模式为大白菜-黄瓜-大白菜。

于2018年11月19日在研究区的同一田块进行采样,采用多点采样法取样,在试验田的未发病中心区域选取呈三角形的3个采样点,每个采样点距离10 m,每个采样点按5点取样法将植株挖出,抖落根部附着的疏松土壤后,收集与根系结合紧密的土壤,混合均匀后合为一个土壤样品,共计3个重复。健康大白菜根际土壤样品采集与罹病植株根际土采样方法一致,土样装密封袋低温带回实验室,过2 mm筛后立即保存在超低温冰箱(-80 ℃)冷冻暂存。

土壤样本的各项理化性质测定由四川省农业科学院土壤肥料研究所分析测试研究室完成,检测方法均依据国家农业标准进行测定。

1.2 土壤微生物总DNA提取、PCR扩增和高通量测序

根际土壤DNA采用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit试剂盒(OMEGA公司,美国)进行提取,利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000(Thermo Scientific公司,美国)分光光度仪检测提取的DNA含量和纯度。对细菌的16S rDNA的V4区进行PCR扩增,采用的引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)[21],利用引物ITS1- 1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3′)和ITS2- 2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3′)对真菌rDNA ITS1区进行PCR扩增[22]。PCR反应体系为50 μL,包括稀释后的模板基因组DNA,带Barcode的特异引物,Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs公司,英国)和高保真酶(Thermo Fisher公司,美国)等。扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共30个循环；72 ℃ 10 min。对扩增的PCR产物进行质量检测,根据产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用2%琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物,剪切目标条带后使用GeneJET (Thermo Scientific公司,美国)胶回收试剂盒回收产物。将纯化质量合格的PCR产物用于DNA文库构建,委托北京诺和致源科技有限公司执行建库及测序工作。

1.3 数据处理和统计分析

下机的数据经Cutadapt(V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)过滤掉低质量reads,随后根据Barcode序列将reads拆分并截去引物序列和Barcode标签,得到原始数据(Raw reads),再通过去除嵌合体序列处理,最终得到有效数据(Clean Reads)[23]。使用Uparse软件(Uparse v7.0.1001,http://www.drive5.com/uparse/)将97%以上一致性的Clean Reads聚类为一个操作分类单元(OTU, Operational Taxonomic Unit)[24],使用Qiime软件(Version 1.9.1)中的比对方法(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)与数据库Unit(v7.2, https://unite.ut.ee/)对OTUs进行物种注释分析,并在各分类水平上统计样本的群落组成[25-26]。OTUs间的系统发生关系则通过MUSCLE(Version 3.8.31,http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对[27]。最后得到的各样品数据,以样品数据量最少的为标准进行均一化处理。

通过Qiime软件(Version 1.9.1)计算α-多样性指数,配对样本T检验进行理化性质数据和样本间的α-多样性指数差异分析,利用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线,主坐标分析(PCoA)图用R软件的WGCNA,stats和ggplot2软件包绘制,对环境因子进行筛选的方差膨胀因子检验(VIF, Variance inflation)使用的是vegan包中的vif.cca函数,冗余分析(RDA, Redundancy Analysis)是通过vegan包中的rda函数进行的排序分析。

2 结果与分析

2.1 罹病与健康植株根际土壤理化性质差异

对患根肿病的大白菜和健康株根际土壤进行理化性质测定,结果显示两个区组样本间的有机质、全氮、有效磷含量以及碳氮比无显著性差异(P>0.05),患病植株根际土壤pH值,全磷、全钾、碱解氮和速效钾含量显著低于健康根际土壤(P<0.05),而土壤交换性钙含量显著高于健康植株根际土壤(P<0.05)(表1)。

表1 发病植株和健康植株根际土壤理化性质

Group 1代表患根肿病大白菜根际土壤样本,Group 2表示健康植株根际土壤样本,下同。同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05),同一列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

2.2 根肿病对土壤细菌和真菌群落Alpha多样性影响

对2区组共计6个土壤样本高通量测序,结果显示患根肿病的大白菜根际土壤共获得细菌和真菌有效序列分别为80147和74510条,健康植株根际土壤则获得的细菌和真菌的有效序列数分别为81784和80106条。从表2和表3中可知,无论细菌还是真菌,其测序覆盖度均高达99%以上,说明本试验测序深度接近饱和,土壤中的物种未被测出的概率低,测序结果能够真实反映土壤中细菌和真菌情况。

表2 患根肿病和健康植株根际土壤细菌α-多样性指数

表3 患根肿病与健康植株根际土壤真菌α-多样性指数

分析罹病和健康植株根际土壤微生物α-多样性发现,患病植株根际土壤中检测到细菌OTU数目为1174个,检测到真菌OTU数目为818个,健康株系根际土壤中检测到1343个细菌OTU和890个真菌OTU,2个区组间的细菌OTU数目存在极显著差异(P<0.01)。Shannon指数可反映微生物的多样性程度,而Chao1指数和ACE指数表示土壤中微生物群落物种丰富度[28],从表2可知,患病根际土壤细菌Shannon指数和Chao1指数显著低于健康株根际土壤(P<0.05),并且ACE指数极显著低于健康株根际土壤(P<0.01)。从表3可知,2区组间的真菌OTU数目、Shannon指数、Chao1指数、ACE指数等未达到显著性差异。以上结果表明,患病植株根际土壤细菌数量下降极为明显,且细菌群落多样性程度和丰富度均显著低于健康根际土壤,而根肿病没有改变寄主根际土壤的真菌物种数和各项α-多样性指数。

2.3 根际土壤微生物群落组成和结构分析

图1 门水平下的细菌群落组成Fig.1 Composition of bacterial community at phylum level*表示存在显著性差异(P<0.05

对测序结果进行物种注释,结果显示所测土壤样本中的总计2517个细菌OTUs分属于28门40纲91目168科326属,主要细菌门(相对丰度≥1%)分别是变形菌门(Proteobacteria)61.13%,拟杆菌门(Bacteroidetes)13.43%,放线菌门(Actinobacteria)6.93%,酸杆菌门(Acidobacteria)5.10%,绿弯菌门(Chloroflexi)3.42%,未知细菌门(unidentified bacteria)2.71%,芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)2.37%和厚壁菌门(Firmicutes)1.46%。主要细菌纲(相对丰度≥1%)分别是γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)49.38%,拟杆菌纲(Bacteroidia)13.46%,α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)11.65%,放线菌纲(Actinobacteria)5.35%,酸杆菌纲(Acidobacteria)4.73%,未知细菌纲(unidentified bacteria)2.88%,芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)2.36%以及纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)2.20%,其余细菌门类所占比例均低于1%,共占7.98%。差异分析结果表明,患病植株根际土壤拟杆菌门相对丰度显著高于健康植株根际土壤,但放线菌门相对丰度显著降低(P<0.05)(图1)。细菌纲分类水平上,患根肿病植株与健康株根际土壤在拟杆菌纲、放线菌纲、未知细菌纲和生养光细菌纲上有显著差异(P<0.05)(图2)。

图2 纲水平下土壤细菌群落组成Fig.2 Composition of bacterial community at class level

图3 土壤真菌在门水平上的群落组成Fig.3 Rhizosphere soil fungal phylum community composition

而真菌的1708个OTU隶属于14门41纲87目146科207属,主要真菌门是子囊菌门(Ascomycota)40.97%,担子菌门(Basidiomycota)9.50%,被孢霉门(Mortierellomycota)9.43%,壶菌门(Chytridiomycota)4.33%,其他门占比35.78%。T检验结果表明,2区组在这4个真菌门水平上的相对丰度均存在着显著性差异(P<0.05)(图3)。真菌纲水平上,主要由散囊菌纲(Eurotiomycetes)、被孢霉纲(Mortierellomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)、Rhizophlyctidomycetes纲、壶菌纲(Chytridiomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)等优势菌纲组成,在患病植株根际土壤中,按丰富度由高到低的排列顺序为：被孢霉纲>粪壳菌纲>座囊菌纲>散囊菌>锤舌菌纲>银耳纲>Rhizophlyctidomycetes纲>壶菌纲>伞菌纲,而在健康植株根据土壤中的丰度顺序是：散囊菌纲>粪壳菌纲>银耳纲>被孢霉纲>座囊菌纲>茶渍纲>伞菌纲>锤舌菌纲>壶菌纲> Rhizophlyctidomycetes纲,并且通过物种差异分析,发现患病和健康植株根际土壤中的被孢霉纲、锤舌菌纲、Rhizophlyctidomycetes纲和壶菌纲相对丰度存在显著性差异(P<0.05),并且在散囊菌纲中的相对丰度差异达极显著水平(P<0.01)(图4)。

主坐标分析(PCoA)是通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取最主要的元素和结构,可直观反映样本间的微生物群落结构差异。PCoA可基于Unweighted Unifrac 距离和Weighted Unifrac距离这两种形式进行分析,如果样本间距离相近,说明物种组成结构相似。本研究采用基于Weighted Unifrac距离进行PCoA分析,结果表明,无论是细菌还是真菌,患根肿病后的植株和健康植株根际土壤样本间的距离相差较大,说明根肿病改变了根际土壤微生物群落结构(图5)。

2.4 微生物群落与土壤理化因子相关性分析

采取矩阵检验分析和经方差膨胀因子(VIF)筛选后基于距离的冗余分析(db-RDA)环境因子与微生物群落结构关系,其中环境因子为在2组根际土壤样本间有显著性差异的pH、全磷(TP)、全钾(TK)、碱解氮(AN)、速效钾(AK)和可交换性钙(ECa),微生物群落数据为样品中OTUs的相对丰度,从表4可知,全钾、碱解氮、交换性钙与细菌群落结构存在显著相关性,而对根际土壤真菌群落而言,全钾、速效钾和交换性钙是重要的影响因子。由于对微生物菌群产生影响的相关环境因子较多,并且环境因子存在严重的自相关性,因此在进行环境因子与微生物群落结构分析时,有必要对环境因子进行筛选,VIF检验可以计算每一个环境因子的VIF值,当值大于20时则被认定为无用的环境因子,进而达到过滤筛选环境因子的目的,本研究基于VIF的冗余分析结果如图6所示,对于细菌群落而言,全磷、速效钾和可交换性钙解释了84.69%的总特征值,并且这3个土壤化学因子对根际土壤真菌群落结构的影响,解释了83.33%的总特征值,说明全磷、速效钾和可交换性钙对根际土壤微生物有较大影响。进一步分析表明,速效钾和交换性钙是影响根际土壤微生物群落改变的主要环境因子,且与速效钾呈显著性正相关(P<0.05),与可交换性钙呈显著性负相关(P<0.05)。

表4 土壤理化因子与细菌和真菌群落结构的相关性分析

图6 经VIF筛选后的土壤理化因子与土壤微生物群落冗余分析Fig.6 Redundancy analysis on microbial communities by soil variables after screening by variance inflation factor test

3 讨论

土壤理化性质与植物土传病害的发生有直接的联系,例如钾、钙等元素直接关系到植物的抗病性,氮、磷、钾的比例失调显著增加病害的发生几率,有机质含量多少与土传病害的病情指数呈显著性负相关[20,29- 30]。因此,详细了解土壤理化性质对解释根肿病的发生具有重要意义,本研究的土壤理化性质测定结果显示,患病植株根际土壤的pH值及全磷、全钾、碱解氮、速效钾含量显著低于对照。而pH的下降导致的土壤酸性环境利于根肿病孢子萌发、侵染和传播,试验结果恰与前期研究相吻合,另外,患病植物根际土壤的全钾和速效钾含量显著低于对照也从侧面解释了草木灰防控根肿病的有效性,草木灰的pH值高达12左右,主要成分为碳酸钾,施用草木灰可增加土壤钾含量以及提高pH以恶化根肿病病原菌生存环境,以此达到防控根肿病的目的。病株土样中碱解氮含量下降与宋旭红等[31]的研究结果一致,而碱解氮含量与土壤脲酶活性密切相关,推测病株土壤中的脲酶活性降低影响了碱解氮的形成。通常来讲,土壤中高含量可交换性钙可一定程度减轻病害的危害,但有意思的是患根肿病大白菜根际土可交换性钙浓度要比健康株根际土要明显升高,其原因有可能是根肿病侵染寄主根部后,一方面阻止植物根系对Ca2+吸收,另一方面引起寄主Ca2+外溢,进而增加了根际土壤可交换性钙含量[32-34]。因此,提高土壤pH,增施钾肥,调减氮肥,均衡施肥对于防控根肿病是必要的。

土壤微生物指标是指示土壤健康的重要因子,土壤微生物群落多样性对于土壤生态及作物健康至关重要[16],当根际微生物特别是细菌区系结构合理,多样性程度越高,物种越丰富,作物抗病能力就越强[35],α-多样性分析结果表明,无论是罹病还是健康的植株,其根际土壤中的细菌OTUs数都比真菌的要多,说明根际土壤中细菌种群数量要高于真菌,这与李岩等[36]在研究根际土与非根际土中得出的土壤中微生物以细菌为主一致的结果相似。与此同时,根肿病侵染寄主后,引起寄主根际土壤的细菌数量急剧下降,多样性程度和丰富度也显著低于健康植株根际土壤,有研究认为土壤细菌的数量和多样性的高低在一定程度上反映了土壤的健康状况,细菌型土壤是土壤肥力提高的一个生物指标[17, 37],本研究结果说明根肿病占领根际生态位后,对根际土壤的细菌影响较大,导致土壤中细菌种群数量急剧减少,群落多样性趋于单一,土壤有由“细菌型”向“真菌型”方向转化的趋势,影响到土壤生态系统,从而使得土壤微生态发生变化。

微生物对土壤环境敏感,植物种类、耕作方式、土壤营养状况、气候变化等等均会不同程度改变土壤群落结构和微生物的组成[38-40],植物土传病害发生后,根际土壤的微生物组成和优势微生物也会发生一定程度的改变,李雪萍等[18]研究表明青稞根腐病导致根际土壤的放线菌等其他有益细菌减少,Benizri等[41]研究桃树根部病害对根际土壤微生物关系时,发现桃树根部发病与根际土壤拮抗细菌数量和种类降低有密切联系。在本研究中,根肿病显著改变了根际土壤微生物的群落结构,并且分析群落组成,发现无论是细菌还是真菌,其优势种群丰度存在较为明显的变化,受根肿菌侵染的植株根际土壤放线菌的相对丰度显著降低,生养光细菌等有益微生物数量亦明显下降。另外,子囊菌门、被孢霉门、担子菌门和壶菌门是根际土壤丰度最高的真菌类群,李岩等[36]对枸杞根际土壤真菌群落的研究发现,子囊菌、担子菌和被孢霉是根际土壤中的优势菌群,高雪峰等[42]在短花针茅草原土壤微生物群落研究中发现子囊菌门、接合菌门、担子菌门和壶菌门是优势真菌类群,本研究与这些研究结果的真菌群落主要构成类似。前人报道子囊菌门大多数为腐生菌,对降解土壤有机质等养分循环起着重要作用,是土壤中主要的真菌分解者[43],本试验结果显示健康植株根际土壤子囊菌门丰度显著高于患病根际土壤,说明根肿菌可能对土壤的养分循环也起到了不同程度地干扰作用。除此之外,2个区组间多种真菌类群的相对丰度发生变化,意味着根肿病对土壤中优势真菌群落组成影响较大。

矩阵检验分析表明,土壤理化因子对微生物群落变化密切相关,土壤中全钾、碱解氮和交换性钙对细菌群落结构影响显著,真菌群落结构则与土壤全钾、速效钾和交换性钙相关。经VIF筛选后的冗余分析结果显示,速效钾和可交换性钙是影响细菌和真菌群落结构的主要因子,并且健康植株根际土壤微生物对速效钾表现出正相关性。后续我们通过方差分解分析(VPA, Variance partitioning canonical correspondence analysis)研究土壤各环境因子对微生物群落分布的解释量,发现全钾、速效钾和可交换性钙对根际土壤细菌群落分布差异贡献度达68.43%,对真菌群落分布贡献度为71.79%,说明钾和钙两种元素对根肿病发生和微生物群落变化起着重要作用。综上,根肿病的发生与根际土壤微生态环境失衡显著相关,它改变了微生物结构,影响了微生物群落多样性,特别是生防有益微生物丰富度,与此同时,土壤理化因子与微生物群落结构存在着紧密联系。

4 结论

患根肿病植株根际土壤pH值和全磷、全钾、碱解氮、速效钾含量显著低于健康植株根际土壤,交换性钙含量显著增加；根肿病引起寄主根际土壤细菌数量急剧减少,并且显著降低了根际细菌的丰富度和多样性程度,但真菌物种数、丰富度和多样性程度在罹病和健康植株根际土壤间则无显著性变化；根肿病改变了根际土壤微生物群落结构,提高了拟杆菌、真菌壶菌、被孢霉、担子菌等的相对丰度,降低了放线菌、生养光细菌等有益微生物的相对丰度；土壤微生物群落受多种土壤理化因子影响,其中速效钾和交换性钙是影响患根肿病和健康植株根际土壤微生物结构变化的主要因子。本研究可为优化微生态调控措施,提升植物根际微生态抗性来防控根肿病提供理论依据。