知母多糖的研究进展

贾小舟，张子东，何建鑫，匡海学，王秋红*

(1.黑龙江中医药大学，北药基础应用与研究教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学，广东 广州 510006)

知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)为百合科知母的干燥根茎[1]。于春季和秋季采挖，除去其根须和表面附着泥沙，后晒干，习称“毛知母”[2]；或除其外皮并晒干[3]。其味苦、甘，性寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、生津润燥的功效[4]，主要用于治疗外感热病，内热消渴，骨蒸潮热，肺热燥咳，高热烦渴，肠燥便秘等症[5]。知母作为临床常用药材历史悠久，是常用中药复方的组成部分，其活性成分主要包含有甾体皂苷类[6-7]、双苯吡酮类[8]、黄酮类、有机酸类、木脂素类、多糖类和微量元素等[9]。知母皂苷类成分以甾体皂苷的数量最多，含量最高，而知母中含有最多的成分为多糖组分，是知母的重要物质组成[10]。以往对知母的研究大多关注知母原药材的小分子，近年来国内外学者对知母活性成分之一——糖类化合物进行了深入研究，结果发现知母多糖具有明显的降血糖作用、抗炎作用和抗氧化的功能[11-12]。现通过收集近年来知母的研究论文进行分析，从知母多糖的提取分离纯化、化学成分和药理作用分别进行介绍。

1 提取分离纯化

多糖提取的原料一般采用传统中药或一些待研究植物的干品，将其粉碎过筛，烘干备用。目前多糖的种类繁杂，存在于植物的部位也各不相同，因此，提取方法因目标物的不同而不同。常用的多糖提取方法有水提、碱提、超声抽提以及其他提取剂的提取[13-14]。采用上述提取方法获得的多糖提取液，都含有许多杂质，主要是无机盐、单糖、寡糖、低分子量的非极性物质、高分子量的有机杂质(如蛋白质、木质素)及一些色素[15]，因此，需要对其进行纯化[16]。常采用的纯化方法有透析法、凝胶色谱法、超滤法[17]。常用的除蛋白的方法有Sevag法脱蛋白，Sevag法结合酶法脱蛋白[18]，三氯乙酸法、酶解法、鞣酸法等。常用的脱色方法有吸附法、氧化法、离子交换法、金属络合物法等[19]。常采用离子交换柱层析、分子筛排阻层析、有机溶剂沉淀法进行分级纯化[20]。

王靖等[21]将知母浸泡后得到匀浆后用温度75 ℃蒸馏水进行水浴，离心，上清用乙醇分级醇沉，依次用95%乙醇、无水乙醇、乙醚依次洗涤沉淀物，将沉淀物真空干燥后即为知母粗多糖。黄芳等[22]将知母按料液比1∶10水煎煮2次/h进行提取。合并提取液过滤后浓缩，浓缩液加入高浓度乙醇，使乙醇浓度达到70%，进行分级沉淀得到粗多糖。利用 Sevag法去除蛋白质得到知母总多糖。李炳辉等[23]基于单因素的基础上进行响应面法试验，对知母多糖的理论得率进行预测，确定知母多糖提取的最佳工艺参数：液料比11 mL/g，提取2次，提取时间117 min，提取功率92 W，理论上知母多糖得率可达30.18%。

2 化学成分

多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，与蛋白质和核酸相比，多糖的结构更为复杂，可称之为最复杂的生物大分子。糖的结构沿用了蛋白质和核酸的分类方法，可分为一级、二级、三级和四级。在多糖的结构分析中，一级结构是最重要的，二级～四级结构与多糖的生物功能及其构效关系有着十分重要的关系[24-26]。

知母多糖类成分在知母中占有相当大的比例，但由于研究水平和技术条件的限制，多糖结构鉴定非常困难。目前结构特征较明确的知母多糖主要有知母多糖A、B、C、D，其分子量分别为1.2×106，6.0×104，2.4×104，6.5×104，经酸水解后，知母多糖A含有Rha、Ara、Xyl和Gal，知母多糖B含有Rha、Ara、Xyl和Glc，知母多糖C含有Fuc、Ara、Xyl、Gal和Glc，知母多糖D含有Man和Glc[27]。

王靖等[21]从知母中分离纯化得多糖PS-Ⅰ精品，分子量约为190万，单糖组成为D-甘露糖和D-葡萄糖。吕太勇等[28]分离纯化得AAB1精品，经HPLC、比旋光度测定等方法，AAB1为均一酸性杂多糖，分子量约为5.47×104，经气相色谱分析，表明AAB1由D-木糖(Xyl)、Man、D-半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)和Glc组成，摩尔比为1∶11∶1.75∶7.92∶1.2。杨东升[29]以地道药材“西陵知母”为研究对象测得知母总多糖的含量为14.33%。分离纯化后成功得到知母均一多糖，中性多糖A-1，酸性多糖B-1，B-2。分子量分别为201 000、41 100、10 500。笔雪燕[30]经气相色谱分析分离并鉴定了4种均一糖，AAP3(Rha：Fuc：Ara：Man：Glc摩尔比为38.92∶1.55∶9.26∶2.28∶9.64)，AAP4(Rha：Fuc：Ara：Man：Glc糖摩尔比为31.86∶3.27∶18.4∶1.99∶7.18)，AAP5(Rha：Ara：Man：Glc糖摩尔比为38.23∶3.59∶32.06∶0.99)，AAP6(Rha：Ara：Man：Glc糖摩尔比为31.11∶3.48∶38.23∶2.82)。周晓欢[31]利用离子交换和凝胶层析对知母酸性总糖进行了分离纯化并得到5个不同级分WABP-A2a(975 KDa)、WABP-A2b(104 KDa)、WABP-A2c(3 KDa)、WABP-A3a(1 013 KDa) 和 WABP-A3b(26 KDa)。采用甲基化分析、红外光谱分析、核磁共振对均一级分WABP-A2a、WABP-A2b和WABP-A3a进行了单糖组成测定。这3个部分被证明为连有较多的中性糖侧链的RG-Ⅰ型果胶结构域。侧链中的糖苷键主要类型包括α-1，5-Ara，其中部分Ara的O-3位置被取代，t-Ara链接，高度支化，还含有AG-Ⅰ型果胶侧链中的β-1，4-Gal，WABP-A2b中还含有β-1、6-Gal、β-1、3,6-Gal，以及少量的AG-Ⅱ侧链。采用红外光谱、核磁共振、果胶酶酶解对均一级分WABP-A2c和WABP-A3b进行单糖组成测定，证明WABP-A2c和WABP-A3b的结构中主要为HG型果胶，以及少量的RG-Ⅰ和RG-Ⅱ结构域。三种结构域在WABP-A2c和WABP-A3b中具有不同的比例，并通过共价键进行连接。

3 药理作用

多糖是一种高分子碳水化合物，通过糖苷键连接起来的长链，由多个单糖单元组成[32]。随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖同蛋白质[33]、核酸一样都是非常重要的生物大分子，在生物体的生长和发育上发挥重要作用[34]。目前学界对于多糖活性[35]相关研究主要集中在抗病毒、抗氧化、降血糖、抗肿瘤、免疫调节等方面[36-37]。抗氧化分为以动物模型为基础的体内活性评价及基于化学及仪器分析方法的体外模型评价，调节免疫活性[38-39]是以通过激活巨噬细胞，激活T淋巴细胞及B淋巴细胞。降血糖活性主要通过多糖调节胰岛素并影响糖代谢中的酶活，使组织对葡萄糖的产生作用，从而调节血糖含量，对糖尿病的防治和治疗有一定帮助[40]。目前学者的研究重心大多集中在皂苷及苷元类上[41]。

3.1 抗炎作用

知母总多糖可以显著改善由二甲苯引起小鼠耳廓肿胀和醋酸导致小鼠腹腔毛细血管通透性增高引起的炎症反应[42]。陈万生等[43]通过实验证明模型证实知母总多糖对炎性渗出增加及组织水肿、急性毛细血管通透性增高等由多种致炎剂引起的一系列反映均有明显的抑制作用。对慢性肉芽肿增生有显著抑制作用。知母总多糖通过抑制前列腺素E的合成或者释放，从而使炎症组织中PGE显著减少。雷霞等[44]通过DNFB诱导小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型证实知母多糖组分能显著降低耳肿胀度，抑制T细胞增殖;调节Th1/Th2的平衡，抑制细胞免疫应答，减轻耳部炎症与免疫损伤;抑制LPS诱导的单核巨噬细胞炎症反应，抑制TNF-α和NO释放，呈现出抗炎的功效。

3.2 降血糖作用

知母药材是为常见的中药材，现代临床上人们多用于治疗糖尿病[45]。Kimura等[46]采用口服给药进行研究降血糖方面的研究。王靖等[47]实验研究发现知母多糖具有明显的降血糖作用，无论是灌胃还是腹腔给药，均能降低正常小鼠和四氧嘧啶型小鼠的血糖；也能降低正常小鼠肝糖元的含量。知母多糖抑制α-糖苷酶可能是降低糖尿病模型家兔和小鼠血糖的作用机制。陈丽华等[48]研究报道了知母多糖对α-葡萄糖苷酶的活性随时间的变化先激活后抑制。孙洪伟[49]改进提取工艺得到较纯的知母聚糖。证实了知母聚糖对胰岛D细胞受损有修复作用。使用四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠模型(该模型类似于1型糖尿病)，实验结果表明，知母聚糖可以提高鼠骨骼肌对血液中葡萄糖的摄取能力。2型糖尿病的重要特征是骨骼肌对葡萄糖摄取障碍，由此推断出知母聚糖不仅仅对1型糖尿病发挥作用，同样对2型糖尿病也是有降血糖作用。卢盛华等[50]提取了知母中知母聚糖A、B、C、D的混合物，研究得出知母聚糖能降低正常小鼠和糖尿病大鼠(四氧嘧啶诱发)的血糖，增高肝糖原含量、增加骨骼肌对3H-2-脱氧葡萄糖摄取能力，同时可以减轻四氧嘧啶造成的胰岛组织的损害，其降血糖作用与增加骨骼肌对3H-2-DG摄取、减少肝糖原分解、增加肝糖原合成、使尚未遭到严重损害的胰岛β细胞恢复正常有关。黄彩云等[51]研究发现,知母多糖可降低家兔糖尿病(四氧嘧啶型)的血糖，知母多糖反而对正常家兔的血糖影响比较小，与D860(甲苯磺丁脲)相比，作用时间快，持续时间短。降血糖的机理可能与增加葡聚糖的利用有关，促进脂肪组织对葡聚糖的摄取，使血糖降低，从而产生降血糖作用。姚桂香[52]从知母根茎中分离得到的知母聚糖A、B、C、D具有降血糖作用，其中B的活性最强。朱建成等[53]建立大鼠红细胞磷脂的代谢组学判别模型，综合运用多种统计学分析方法寻找知母多糖治疗2型糖尿病的红细胞磷脂药理标志物。通过交叉检验及置换检验证明，模型可以充分提取组间差异，并具有较好的预测能力。筛选得到的知母多糖红细胞磷脂标志物可为后续的作用机制研究提供参考。刘印等[54]研究了知母多糖可以增加大鼠体质量，并改善对葡萄糖的耐受能力;降低FBG水平，提高FINS水平；也可以降低模型大鼠血清IL-6、TNF-α水平及肝组织MDA含有量，提高肝组织CAT、SOD活性，同时，知母多糖还可以减少肝组织Phospho-IRS1表达，增加Glut4表达。侯红瑞等[55]研究分子量在30～100 kDa知母多糖对链脲佐菌素(STZ)致糖尿病SD大鼠的降血糖效果及其机制，发现对糖尿病SD大鼠的有明显的降血糖、降血脂效果，该作用机制可能与改善胰岛素抵抗和修复受损胰岛细胞组织有关。

3.3 抗氧化作用

3.4 其他作用

卢盛华等[50]研究发现知母多糖可以用作醛糖还原酶抑制剂，以缓解糖尿病的并发症。醛糖还原酶在糖性白内障的发病中起着至关重要的作用，还与糖尿病引起的一系列病变有关，例如角膜、视神经及外周神经的病变[59]。雷霞等[60]对知母盐炙前后水煎液通便作用及化学成分进行比较研究，通过观察生知母、盐知母水煎液对便秘大鼠的通便作用，糖类化合物可能是其滋阴降火作用的物质基础，也是知母甘味的物质基础。

4 结语

现阶段对知母的质量评价[61]及其药效研究主要集中在皂苷类和黄酮类等成分上，究其原因，主要是国内目前对知母多糖的分离和纯化缺乏系统的研究[62]。化学结构明确、纯度较高的知母多糖对照品也将成为影响知母药材质量标准提高和完善的一个极其重要的因素。多糖及共缀合物的研究可以追溯到100多年前，在生物化学领域，由于人类的不断努力，在微观细胞水平上逐渐进行了有关活性多糖的机理机制研究，在研究较成熟的多糖(香菇多糖)已有了分子水平的发现[63]。对多糖类的研究虽然也取得了一些巨大成就，但与蛋白质和核酸的研究相比，多糖类的研究还不够深入，还具有很大差距，任重而道远。