炮制对山茱萸有效成分含量的影响

鲁静，陈天朝，马彦江，牛晓静

(河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、收涩固脱的功效[1]。其炮制历史悠久，方法较多，有炒、蒸、酒制、脂制等[2]，目前以《中国药典》所收载的酒蒸法或酒炖法为主。山茱萸生品敛阴止汗力强，酒制后借酒力温通，助药势，酸性降低，滋补肝肾作用增强[3]。

现代研究表明，山茱萸中含有环烯醚萜苷类、黄酮类、有机酸类和鞣质类等成分[4]，其中环烯醚萜苷类成分莫诺苷、马钱苷具有抗神经退行性病变、抗血栓、抑制黑素、抗糖尿病等作用[5]。美拉德反应是一类广泛存在于中药加工炮制过程中，以氨基化合物与羰基化合物为底物的非酶褐变反应[6]，5-羟甲基糠醛是该反应重要的中间产物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抗组织缺氧等药理活性[7]。本课题组对其炮制前后马钱苷、莫诺苷、还原糖及5-羟甲基糠醛(5-HMF)等成分的含量进行对比研究，以探讨酒蒸工艺对山茱萸有效成分的影响,现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

GZX-9146MBE型电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；HH-S4A型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；BSA224S-CW型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；JW-2018H型高速离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；Evolution201型紫外分光光度计(赛默飞世尔科技公司)；Ultimate 3000型号高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司)。

1.2 药材与试剂

山茱萸(批号：1702091，产地浙江)由安徽普仁中药饮片有限公司提供，经河南中医药大学第一附属医院药学部陈天朝主任药师鉴定为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉。马钱苷(批号：111640-201005，含量99.2%)、D-无水葡萄糖(批号：110833-201707，含量99.9%)(中国食品药品检定研究院)；5-HMF(批号：A22J7L16607，含量≥98%)、莫诺苷(批号：Z12O8B45504，含量≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司;黄酒(批号：20190110，度数10.0%,浙江古越龙山酒业有限公司);乙腈、磷酸为色谱纯;甲醇、乙醇、硫酸等为分析纯。

2 酒萸肉的制备

酒萸肉以酒蒸法(《中国药典》2015年版四部通则0213)制备。取山茱萸适量，加20%黄酒拌匀，润透，蒸至酒吸尽，取出，置于烘箱中在60 ℃烘干1.5 h，即得。

3 方法与结果

3.1 HPLC法测定5-HMF、莫诺苷和马钱苷的含量

3.1.1 色谱条件与系统适用性

采用Agilent 公司Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～20 min，7% A；20～50 min，7%～20% A；50～50 min，7%～20% A)，柱温为35 ℃，检测波长为240 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。5-HMF、莫诺苷和马钱苷混合对照品、山茱萸及酒萸肉的HPLC色谱图见图1。

注：a对照品色谱图,b山茱萸样品色谱图,c酒萸肉样品色谱图；1 5-HMF,2莫诺苷,3马钱苷图1 高效液相色谱图

3.1.2 混合对照品溶液的制备

取5-HMF、莫诺苷和马钱苷适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 mL分别含5-HMF、莫诺苷和马钱苷0.377 mg、0.515 mg和0.500 mg的混合对照品溶液。

3.1.3 供试品溶液的制备

取山茱萸或酒萸肉样品，粉碎，过3号筛。取粉末约0.2 g，精密称定，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷后再次称定，补重，摇匀，过滤，滤液于5 000 r/min离心15 min，取上清液，即得。

3.1.4 标准曲线的绘制

分别精密移取混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于50 mL容量瓶，用50%甲醇水定容，配制不同浓度的标准溶液。进样测定，结果见表1。按“3.1.1”色谱条件进行测定，以对照品的浓度(μg/mL)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，5-HMF的回归方程为Y=0.149 3X+0.037，r=0.999 9，线性范围为7.54～75.4 μg/mL，莫诺苷的回归方程为Y=0.312 7X+0.091 1，r=0.999 9，线性范围为10.3～103 μg/mL，马钱苷的回归方程为Y=0.279 7X+0.131 5，r=0.999 8，线性范围为10.0～100 μg/mL。

3.1.5 精密度试验

取酒萸肉样品制备的供试品溶液，按“3.1.1”色谱条件进行测定，共6次，5-HMF、莫诺苷和马钱苷峰面积的RSD分别为0.5%、0.7%和0.8%，表明仪器精密度良好。

3.1.6 重复性试验

按“3.1.3”的方法制备酒萸肉样品的供试品溶液，共6份，按“3.1.1”色谱条件进行测定，计算得到的5-HMF、莫诺苷和马钱苷含量的RSD分别为1.9%，1.8%和2.1%，表明该方法重复性良好。

3.1.7 稳定性试验

取酒萸肉样品的供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进行色谱测定。5-HMF、莫诺苷和马钱苷峰面积的RSD分别为1.3%、1.2%和1.5%，表明供试品溶液中3种成分在24 h内稳定。

3.1.8 加样回收率试验

取山茱萸或酒萸肉样品，粉碎，过3号筛。取粉末约0.1 g，精密称定，共6份，分别加入混合对照品溶液1 mL，按“3.1.3”制备供试品溶液，按“3.1.1”色谱条件进行测定，5-HMF、莫诺苷和马钱苷的平均回收率为98.3%、98%和97.9%，RSD为3.3%、3%和3.2%。

3.1.9 样品中5-HMF、莫诺苷和马钱苷含量的测定

取山茱萸、酒萸肉样品，按“3.1.3”制备供试品溶液，按“3.1.1”色谱条件进行测定，计算样品中5-HMF、莫诺苷和马钱苷的含量，结果见表1。

表1 山茱萸各样品中5-HMF、莫诺苷和马钱苷的含量

3.2 DNS法测定还原糖的含量

3.2.1 DNS溶液的配制

取3，5-二硝基水杨酸6.5 g，加入少量蒸馏水溶解，转移至1 000 mL容量瓶中，再加入2 mol/L的NaOH溶液325 mL、丙三醇45 g，混匀，用蒸馏水定容至刻度，即得。

3.2.2 对照品溶液的制备

取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加蒸馏水配制成浓度为1.00 4 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

3.2.3 供试品溶液的制备

取山茱萸或酒萸肉样品，粉碎，过3号筛。取粉末约1.0 g，精密称定，加水50 mL，搅匀，在水浴锅中于50 ℃放置1 h。将溶液转移至离心管，于5 000 r/min离心10 min，取上清液，沉淀再加入水50 mL，重复提取1次，合并2次上清液，转移并定容至100 mL，摇匀，即得。

3.2.4 标准曲线的绘制

精密吸取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞刻度试管，加水至1 mL，摇匀，再加入DNS溶液2 mL，混匀，在沸水浴中加热5 min，立即冷却，转移并定容至25 mL。以蒸馏水为空白，在540 nm处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，葡萄糖浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线为：A=0.665 8C+0.001 1(R2=0.999 5)，结果表明，葡萄糖在200.8～100 4 μg/mL浓度范围内与吸光度线性关系良好。

3.2.5 精密度试验

精密吸取酒萸肉样品的供试品溶液，按“3.2.4”方法显色，测定6次，吸光度的RSD为0.5%，表明仪器精密度良好。

3.2.6 重复性试验

按“3.2.3”方法制备酒萸肉样品的供试品溶液，共6份，按“3.2.4”方法显色，测定吸光度，计算得到的还原糖含量的RSD为1.9%，表明该方法重复性良好。

3.2.7 稳定性试验

精密吸取酒萸肉样品的供试品溶液，按“3.2.4”方法显色，分别于5、10、15、20、25、30 min测定吸光度，RSD为0.8%，说明供试品溶液在30 min内稳定。

3.2.8 加样回收率试验

取酒萸肉样品约0.5g，精密称定，共6份，分别精密加入12.69 mg/mL葡萄糖对照品溶液2 mL，按“3.2.3”方法制备酒萸肉样品的供试品溶液，按“3.2.4”方法显色，测定吸光度，还原糖的平均回收率为98.4%，RSD为3.7%。

3.2.9 还原糖含量的测定

精密量取供试品溶液1 mL，置于具塞试管中，加入DNS溶液2 mL，混匀，在沸水浴中加热5 min，立即冷却，转移并定容至25 mL，在540 nm处测定吸光度。计算样品中还原糖含量，结果见表2。

表2 山茱萸各样品中还原糖的含量

4 讨论

2015年版《中国药典》一部山茱萸项下采用HPLC法测定莫诺苷和马钱苷的含量，检测波长为240 nm，试验中发现，5-HMF在240 nm处的吸光度虽不及最大吸收波长284 nm处的吸光度，但能满足定量测定要求，故最终确定检测波长为240 nm。

还原糖的测定方法主要有DNS法、MBTH法和铁氰化钾法等[8]，本试验采用较为常用的DNS法，该法简便、快速、准确、稳定[9]。考察了不同DNS试剂用量(0.5、1、2、3、4、5 mL)对测定结果的影响，发现随着用量的增加，吸光度值逐渐升高，用量超过2 mL，吸光度值趋于稳定，因此，选择DNS试剂的用量为2 mL。然后考察了不同加热时间(2、5、10、15、20 min)对测定结果的影响，结果显示，吸光度值在加热5 min时最高，加热时间的持续增加对吸光度值影响不大，最终确定加热时间为5 min。

研究结果表明，山茱萸炮制后生成了5-HMF，而马钱苷、莫诺苷、还原糖的含量有所降低。5-HMF作为酒萸肉相对于生品新增的活性化合物，可能是酒萸肉滋补肝肾作用增强的原因之一[7,10]。本试验进一步考察了蒸制时间对4种有效成分的影响，发现随着蒸制时间的增加，酒萸肉中5-HMF的含量不断增加，莫诺苷、还原糖的含量持续降低，马钱苷的含量相对比较稳定。因此，为控制酒萸肉的质量，酒蒸的终点应以“蒸至酒吸尽”为宜，时间过长，可能会影响成品的功效，变化较明显的莫诺苷、还原糖、5-HMF等成分，可作为监测炮制程度的指标。