火焰南天竹茎段离体培养再生体系的优化

叶 雯，袁超群，秦 伟，王振涛，朱玉球

（1.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州311300；2.嘉兴中瑞生物科技有限公司，浙江 嘉兴 314051）

火焰南天竹Nandina domestica‘Firepower’为园艺新品种，植株矮小、株型紧凑，茎节短，只有南天竹N.domestica的1/10，叶片呈卵形或者椭圆形，和南天竹披针形叶存在着明显的区别[1-4]。当气温下降到5℃以下且昼夜温差超过10℃时，叶片呈火红色，经霜不落，春夏季呈淡绿色，极具观赏价值与经济价值，市场需求量大[1-2]。常采用扦插繁殖，繁殖周期较长，繁殖率极低，并且扦插容易感染病毒，造成品质退化。已有报道利用组织培养技术解决火焰南天竹繁殖数量少、繁殖速度慢、种质易退化等缺点[3-10]，虽然能够通过愈伤组织、茎尖和叶片等作为外植体获得不定芽，但增殖系数相对较低[6,11]。有些虽然能够大规模生产，培养基配方中使用蔗糖[12]，成本较高，距规模化、产业化生产还有一定的差距。鉴于此，本研究以火焰南天竹不带叶茎段为外植体，进行离体快繁影响关键因子优化，建立适合大规模生产的火焰南天竹茎段离体快速繁殖技术体系，旨在为火焰南天竹种苗高效、快捷和稳定生产提供技术和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

火焰南天竹由嘉兴中瑞生物科技有限公司提供。选择生长健壮、无病虫害的火焰南天竹优良单株的嫩枝条为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 火焰南天竹芽生长基本培养基筛选 以1/2MS、WPM、DCR、B5为基本培养基，分别添加6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.50 mg·L-1，萘乙酸（NAA）0.20 mg·L-1， 蔗糖 30.0 g·L-1，卡拉胶 7.0 g·L-1（pH 5.8），进行芽生长基本培养基筛选。选取长0.5～1.0 cm带节茎段，保持极性，接种于不同筛选培养基上，接种茎段10个·瓶-1，每种培养基接种10瓶，于1 500～3 000 lx光照，（25±2）℃培养40 d后，观察和统计芽诱导、增殖和生长情况。

1.2.2 不同质量浓度6-BA和NAA配比对火焰南天竹芽诱导和增殖的影响 选取1.2.1筛选的理想基本培养基， 添加不同质量浓度 6-BA（0、0.25、 0.50、0.75、 1.00 mg·L-1）和 NAA（0.10、0.50 mg·L-1）组成 10种不同配方培养基，以初代培养获得无菌芽苗为试材，剪取带节的茎段，接种在培养基上，接种茎段10个·瓶-1，培养条件同1.2.1。培养40 d后，统计芽诱导、增殖情况。

1.2.3 火焰南天竹幼苗的生根培养 ①生根基本培养基的筛选。选取约3 cm高的无菌芽苗，分别接种在添加 0.25 mg·L-1IBA+0.25 mg·L-1NAA+30.0 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶（pH 5.8）的 1/2MS 和 1/2WPM基本培养基上。接种芽苗10株·瓶-1，每种培养基接10瓶。②生根最佳NAA质量浓度的筛选。选取约3 cm高的芽苗分别接种在添加不同质量浓度（0.10、 0.30、 0.50 mg·L-1）NAA， 30.0 g·L-1蔗糖， 7.0 g·L-1卡拉胶（pH 5.8）的生根理想基本培养基上，接种芽苗10株·瓶-1，每种培养基接10瓶。③生根白砂糖质量浓度的筛选。蔗糖是组织培养中最好的碳源，但种苗规模化生产过程中，降低成本是很有必要的，为此研究白砂糖不同质量浓度对火焰南天竹生根的影响。选取约3 cm高的芽苗，分别接种于20.0、30.0、40.0 g·L-1白砂糖的生根培养基（pH 5.8）上，以30.0 g·L-1蔗糖为对照。接种芽苗10株·瓶-1，每种培养基接10瓶。④试管苗生长的最佳pH值筛选。将约3 cm高的芽苗分别接种于不同pH值（5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8、9.2）的生根培养基上，接种芽苗10株·瓶-1， 每种培养基接10瓶。以上筛选试验培养条件同1.2.1，培养30 d后，统计生根率。

1.2.4 培养条件的筛选 将0.5～1.0 cm长带节火焰南天竹茎段接种在前期筛选的芽诱导、增殖和生根的最佳培养基上，接种后分别暗培养0、5、15 d后，于1 500～3 000 lx光照，时间12 h·d-1，（25±2）℃下进行芽诱导、芽增殖、生根培养等试验，每处理接种10瓶，外植体10个·瓶-1，统计其生长情况，筛选出各培养阶段的合适条件。

1.2.5 数据统计与分析 采用Excell和SPSS 17.0对所得数据进行统计分析和作图。芽诱导率、生根率和芽增殖系数计算公式如下：芽诱导率=出芽外植体数/接种数×100%；生根率=生根外植体数/接种数×100%；芽增殖系数=外植体诱导芽数/外植体接种数。

2 结果与分析

2.1 基本培养基对火焰南天竹芽生长的影响

由表1可知：基本培养基对火焰南天竹芽诱导有明显的影响。DCR对火焰南天竹的芽诱导效果最好，出芽率高达96.8%；其次是WPM和1/2MS，芽诱导率分别为90.2%和85.0%，而B5的芽诱导率只有43.2%。因此，选择DCR火焰南天竹茎段芽诱导较理想的基本培养基。培养40 d后，在WPM上，芽的增殖倍数和芽高分别为3.18和1.18 cm，植株生长健壮，叶色绿色，叶片舒展宽大；在DCR上芽增殖倍数为2.05，芽高0.95 cm，植株生长正常，叶色绿色，但叶小卷曲。而在1/2MS和B5培养基上，芽的增殖位数仅为1.52和1.06。4种基本培养基无机盐质量浓度从高到低依次为B5、1/2MS、DCR、WPM，因此，可以推断低质量浓度无机盐有利于火焰南天竹芽诱导、繁殖和生长。因此，综合芽诱导、增殖和植株生长情况等，选择WPM为本试验的理想基本培养基。

表1 基本培养基对火焰南天竹出芽的影响Table 1 Effect of basic media on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.2 6-BA和NAA对火焰南天竹芽诱导与芽增殖的影响

由图1可见：6-BA和NAA的质量浓度对芽的诱导和增殖影响差异极显著（P=0.000 1）。当NAA质量浓度一定时，随着6-BA质量浓度的增加，火焰南天竹的出芽率及芽的增殖倍数呈上升趋势，当6-BA达1.00 mg·L-1时，出芽率及芽的增殖倍数达最高值，但芽生长缓慢，叶小，叶片皱褶卷曲，新生幼叶脆弱，易玻璃化，不利于芽苗的生长。综合分析表明：芽诱导理想培养基为WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，芽诱导率高达93.0%；芽增殖的理想培养基为WPM+0.75 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，芽增殖倍数为3.3，新芽生长良好，叶片舒展宽大，叶色鲜绿（图2A）。方差分析可知：6-BA和NAA两者互作的差异不显著（P=0.998 1）。

2.3 火焰南天竹试管苗生根条件的筛选

2.3.1 基本培养基对火焰南天竹试管苗生根的影响 由表2可见：基本培养基对火焰南天竹试管苗生根有一定的影响，火焰南天竹在WPM上的生根优于1/2MS培养基，在WPM上的生根率、平均根数分别是1/2MS的3.1和2.6倍，且试管苗生长良好，叶片舒展、鲜绿色。因此，低质量浓度无机盐的WPM培养基有利于试管苗生根和生长。

2.3.2 NAA对火焰南天竹试管苗生根的影响 由表3可知：NAA质量浓度对火焰南天竹芽苗生根影响明显，随着NAA质量浓度的增加，试管苗的生根率、平均生根数有明显增加，但对根长的生长影响不明显。当NAA质量浓度达0.50 mg·L-1时，试管苗生根率高达91.0%，平均根数为5.4根，试管苗生长正常。

图1 不同培养基组合对火焰南天竹不定芽诱导率和芽增殖倍数的影响Figure 1 Effects of different media combinations on adventitious bud induction rate and bud proliferation times of N.domestica‘Firepower’

表2 基本培养基对火焰南天竹生根的影响Table 2 Effect of basic media on rooting of N.domestica‘Firepower’

表3 NAA对火焰南天竹生根的影响Table 3 Effect of NAA on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.3.3 白砂糖浓度对火焰南天竹生根的影响 由表4可知：添加白砂糖30.0 mg·L-1的培养基中火焰南天竹的生根率可达90.4%，平均根数达5.1且植株正常，生长较好，叶片绿色（图2B和2C），与添加蔗糖30.0 mg·L-1的培养基中的生根差异不显著。综合成本和生根情况考虑，大规模种苗生产过程中，可用相同质量浓度的白砂糖替代蔗糖作为碳源。

表4 白砂糖质量浓度对火焰南天竹生根的影响Table 4 Effect of sugar on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.3.4 pH值对火焰南天竹生根的影响 由表5可见：pH为6.0时，生根率达95.0%，平均生根数和根长分别为6.1根和1.07 cm，好于其他pH的生根情况。当pH≥6.2时，火焰南天竹生根的各项指标明显下降，致使植株瘦弱，生长缓慢甚至停止生长。因此，火焰南天竹生根培养基的最佳pH为6.0。

表5 pH值对火焰南天竹生根的影响Table 5 Effect of pH value on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.4 培养条件对芽诱导、增殖和生根的影响

在火焰南天竹的组培过程中器官的形成所需培养条件不同，接种后暗培养5 d后转为光照培养有利于芽的诱导和增殖；生根培养条件为接种后在光强1 500～3 000 lx，光照时间12 h·d-1，温度为（25±2）℃ 条件下培养（表6）。

表6 培养条件对芽诱导、增殖和生根的影响Table 6 Effect of culture conditions on rooting of N.domestica‘Firepower’

图2 火焰南天竹不定芽诱导、增殖和生根培养Figure 2 Adventitious bud induction,proliferation and rooting culture of N.domestica‘Firepower’

3 结论

节间较短，枝条细弱，株形矮小，枝条数量有限，这些制约了火焰南天竹的分株和扦插繁殖，使火焰南天竹不能满足市场的需求[11-12]。为了扩大火焰南天竹的繁殖率，近年来植物组织培养技术已应用于火焰南天竹的繁殖，一定程度打破火焰南天竹自然繁殖力低的限制，加快繁育速度，但在生长过程中发现基因型和环境条件仍然制约着火焰南天竹扩繁。本研究对影响火焰南天竹组织培养再生体系的关键因子进行了优化。糖是植物组织培养中提供培养物所需要的碳骨架和能源，是维持培养基稳定的渗透压不可缺少的碳源物质。本研究发现：30.0 mg·L-1白砂糖和蔗糖分别作为碳源的培养效果差异不显著，因此考虑到成本问题，规模化生产火焰南天竹时可用白砂糖代替蔗糖。火焰南天竹试管苗生根培养基适宜的pH为5.8～6.0，尤以pH为6.0时生长良好，与李慧[8]研究结果基本一致，同邓玉营等[9]的研究结果稍有出入，可能是由于所用火焰南天竹的基因型不一致所导致。

本研究以火焰南天竹茎段为材料，优化了火焰南天竹的组织培养再生体系的影响因素，优化的体系为：不定芽诱导理想培养基为WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，不定芽增殖培养基为WPM+0.75 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA， 生根培养基为 1/2WPM+0.50 mg·L-1NAA+白砂糖 30.0 g·L-1，pH 6.0。