海南西海岸真红树内生细菌多样性及其延缓衰老活性研究

李蜜 高程海 姜舒 韦娟 刘思萍 戴恩枝 易湘茜

摘 要：该文设计9种分离培养基，采用稀释涂布法从14份真红树植物的46份组织样品中分离纯化内生细菌。并基于菌株形态学特征和16S rRNA基因序列确定分离菌株的种属及分析其物种多样性，采用秀丽隐杆线虫模型筛选菌株延缓衰老活性。结果表明：（1）通过基因序列去重复后从46份真红树植物组织样品中获得32株海洋细菌，基于菌株16S rRNA基因序列信息分析，覆盖12科17属，其中芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌属，并获得1株疑似橙单胞菌属（Aurantimonas）新种，16S rRNA基因序列相似性低于97%;（2）经过秀丽隐杆线虫粗筛发现3株海洋细菌具有显著延缓线虫衰老的活性（P<0.05）。以上结果表明海南西海岸真红树内生细菌具有物种多样性，部分菌株具有延缓线虫衰老活性。

关键词：真红树植物，内生细菌，物种多样性，延缓衰老活性

Abstract：The bacteria were isolated and purified from 46 tissues of 14 true mangrove plants used nine kinds of isolation media by dilution coating method. The bacteria were isolated from strains，and the species and genus diversities were analyzed by bacteria morphological characteristics and 16S rRNA gene sequences. The anti-aging activities of the bacteria were tested by Caenorhabditis elegans screening models. The results were as follows：（1） The 32 marine bacteria were obtained from 46 tissues of true mangrove plants without repeatitions. The 32 bacteria to comparison of 16S rRNA gene sequences which could be classified into 12 families and 17 genera. The dominant genus were Bacillus. It was discovered that a novel strain of suspected genus Aurantimonas，which 16S rRNA gene sequence similarities were less than 97%; （2） The three cultured marine bacteria could significantly delay Caenorhabditis elegans developing and had dominant anti-aging activities（P<0.05）. All the above results indicate that the true mangrove plants collected from the west coast of Hainan have high species diversity and part strains are rich in anti-aging activity.

Key words：true mangrove plants，endophytic actinobacteria，species diversity，anti-aging activity

全世界紅树植物共有24科30属83种，主要分布在美洲、非洲和东南亚的热带和亚热带经济不发达地区（Holguin et al.，2001）。中国红树林主要分布于福建、海南、广东和广西等省（区）的沿海地区，其中真红树植物有11科24种（廖宝文等，2014）。林鹏等（1997）认为真红树植物是指专一地生长于潮间带的木本植物。红树林生长于缺氧、高养分和高盐等特殊环境，可产生大量结构丰富和活性显著的次级代谢产物（袁献温等，2009;沈明曦等，2011）。而生活在其组织内部的微生物，受特殊环境的影响易产生遗传变异从而使物种多样性丰富，代谢产物药理活性独特。近年来，从红树林植物中发现大量储藏在植物内部的微生物，主要活性有抗菌（李家怡等，2017）、抗病毒和细胞毒（李菲等，2016）等。李家怡等（2017）从广西山口红树林自然保护区采集的红海榄中分离得到17株内生细菌，其中3株对副溶血弧菌具有较强的抑菌活性。刘月廉等（2010）从秋茄、白骨壤、无瓣海桑三种真红树植物的540 块组织中分离到内生细菌90株，其中菌株AC2对致皮肤病真菌具有较强的拮抗性。李菲等（2016）采用稀释涂布法，从无瓣海桑中分离得到38株内生细菌，其中5株具有较强的细胞毒活性。李菲等（2017）从广西北海金海湾红树植物秋茄中得到50株内生细菌，并筛选出37株细菌对甘蔗黑穗霉菌有抑制作用。由此可见，真红树细菌资源丰富，且药理活性独特，其多样性值得我们深入研究。

当代社会，人类生活水平与上个世纪相比较显著提高，但人口老龄化趋势日趋显著（曾尔亢等，2012）。人口老龄化的加剧使得抗衰老不容忽视，同时也是急需解决的问题。红树林生态资源丰富，其中滋养着多样性丰富的微生物，从红树林微生物中发现延缓衰老药物是我们研究的关键问题。红树林位于海陆交界处，兼具有海洋和陆地的特征又存在区别。据资料显示，真红树内生微生物次级代谢产物的化学和药理活性研究报道很多，但关于微生物代谢产物粗提物延缓衰老的药理研究相对偏少。国内外利用秀丽隐杆线虫模型主要研究中药提取物和保健产品的抗衰老，海洋微生物发酵产物对线虫延缓衰老的研究鲜有报道。陈亮稳等（2013）发现蜜环菌菌索多糖能显著延长秀丽隐杆线虫的生存期，并对其生殖力无损害。Petrascheck et al.（2007）利用秀丽隐杆线虫筛选抗衰老药物，共筛选了8.8万个化合物，发现115个化合物能延长线虫的寿命。本课题组（李蜜等，2018）利用秀丽隐杆线虫模型发现2株具有延缓衰老的海洋放线菌，能有效延迟线虫的死亡时间。

海南西海岸位于北部湾湾区，其红树林物种多样性丰富，并且滋生丰富的微生物资源。因此发掘其中真红树内生细菌多样性差异对海洋细菌资源的开发利用具有重要意义。本实验以海洋真红树植物为研究对象，采用稀释涂布法对其展开内生细菌多样性研究;利用秀丽隐杆线虫衰老模型对其代谢产物粗提物进行延缓衰老活性筛选。为挖掘更多潜在新物种以及真红树细菌潜在的药理活性、为研究新型抗衰老药物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

真红树植物样品：14份真红树植物样品于2017年7月采集于海南西海岸区域，具体样品信息如表1，根部位5份样品，茎14份，叶13份，花2份和胚轴12份，共46份真红树植物组织。其中，H1-H7真红树植物地理位置为109°59′37″ E、19°55′07″ N，H8-H14地理位置为109°31′50″ E、19°51′26″ N。样品用无菌水冲洗其表面以去除表面杂质，立即装入自封采样袋，置于采样冰盒中24 h内送回实验室，置-20 ℃冰箱保存备用。野生型秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）均由广西科学院汪斌博士提供。

1.2 方法

1.2.1 分离培养基 分离培养基参考李飞娜等（2017）设计如下9种，AGG：改良的高氏培养基;M4：海藻糖-天冬酰胺培养基;M5：海藻糖-脯氨酸培养基;M7：改良ISP5培养基;M9：精氨酸-天冬酰胺培养基;M10：改良淀粉-水解酪素培养基;P7：酪氨酸-天冬酰胺培养基;P3：燕麦培养基;M11：棉籽糖-组氨酸培养基。详细配方信息如表2所示，每种培养基加入1 L海水、10 mL的复合盐溶液和20 g的琼脂，调节pH7.2，均于121 ℃下灭菌20 min（复合盐溶液：KNO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NH4NO3  0.1 g，FeSO4 0.01 g，MnCl2·H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g和去离子水10 mL）。待培养基温度降至50 ℃时加入抑制剂重铬酸钾使其终浓度为25 mg·L1，混匀。

纯化及保藏培养基：改良ISP2固体培养基，酵母提取物2.0 g，麦芽提取物2.0 g，葡萄糖2.0 g，琼脂20.0 g和海水1 000 mL。

发酵培养基：ISP2液体培养基。

1.2.2 红树植物样品的处理 参考李家怡等（2017）方法，对红树植物样品进行表面除杂和消毒，5%次氯酸钠溶液浸泡8 min，无菌水冲洗至没有残留;75%的酒精溶液浸泡5 min，无菌水冲洗至无酒精。取大约2 g的新鲜样品进行研磨，吸取2 mL无菌水与样品混匀，该浓度液作为样品原液，再用无菌水依次稀释到103和104组织悬液，置于4 ℃冰箱暂存。

1.2.3 菌株的分离纯化及保藏 取103和104组织悬液0.2 mL，分别涂布于9种不同成分的分离培养基中，置于28 ℃恒温培养箱培养14～30 d;通过形态观察，挑选表面光滑的单菌落在ISP2培養基上进行三区划线纯化，如有杂菌则进行二次纯化或多次纯化，直至得到单一纯净的菌落，同时记录菌落数及菌落的形态特征。纯化好的菌株制成20%（V/V）甘油管保藏于-80 ℃。

1.2.4 PCR扩增和系统发育树分析 采用Chelex-100 Resin法（周双清等，2010）提取基因组DNA;并参照Walsh et al.（1991）的方法进行PCR梯度扩增。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，Bio-RAD凝胶成像仪成像观察电泳结果。凝胶成像仪检验条带合格后委托上海美吉生物医药技术有限公司广州分公司进行测序。

测序结果经DNA Star软件整理，利用数据库EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）（Kim et al.，2009）进行在线比对;对16S rRNA基因序列进行相似性比对搜索，从中选取相似性较高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA基因序列作为参比对象。

1.3 延缓衰老活性实验

1.3.1 红树林细菌粗提物的制备 参考覃媚等（2016）的方法：将32株对数生长期的菌株接种于200 mL液体培养基中发酵7 d，离心收集发酵液，发酵液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层浓缩备用;收集粗提物，置于干燥器中低温保存。

1.3.2 NGM （nematode growth medium）培养基的配制 参考Brenner（1974）的方法：加入3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、17 g琼脂、1 mol·L1 K2HPO4-KH2PO4 Buffer （pH=6.0） 25 mL、975 mL蒸馏水进行灭菌。灭菌后加入抽滤除菌的5 mg·mL1胆固醇溶液1 mL、1 mol·L1 MgSO4 1 mL、1 mol·L1的 CaCl2 1 mL。

1.3.3 秀丽隐杆线虫延缓衰老活性测试方法 真红树内生细菌代谢产物粗提物样品分两批次进行线虫寿命实验，第一批次总共采集得到11个样品的寿命数据，样品详情如表4所示，第二批次总共采集得到8个样品的寿命数据，具体数据如表5所示。

实验步骤：用M9缓冲液将虫体洗净离心弃上清液，以1∶3的比例加入裂解液（1 mL 5 mol·L1的NaOH和0.5 mL 5%的NaClO混匀使用），震荡离心后，分别加入20 μL大肠杆菌发酵液、30 μL线虫pellet、150 μL M9 Buffer于96孔板的各个孔中，设置阴性对照。 置于 20 ℃ 生化培养箱中培养 48 h 后可得L4期线虫。将培养好的L4期线虫挑至加有药液（药液浓度500 μg·mL1，每次加50 μL）的NGM培养基上进行培养，每组2板，每板20条，此时培养天数记为0 d。此后，隔天对培养基的线虫进行计数，每天观察并记录线虫生存、死亡及剔除的数量，将线虫每2 d转移至新的培养皿，直至线虫全部死亡。得出平均寿命和最大寿命值。

1.4 统计分析

所有数据采用软件SPSS Statistics 17.0进行统计分析，并用软件Excel 2013做表、绘图，通过DNA Star软件进行序列整理。

2 结果与分析

2.1 红树植物内生细菌多样性分析

根据菌落特征进行初步排重后，选择58株菌进行16S rRNA基因扩增和序列分析，结果表明32株为细菌，分布于4个纲10个目12个科17个属，其物种组成多样性分布如表3所示。32株红树林植物内生细菌在17个属的多样性分布如图1所示，其中橙单胞菌属（Aurantimonas）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、盐单胞菌属（Kushneria）、Salinicola、沙雷氏菌属（Serratia）、 根瘤菌属（Rhizobium）、弧菌属（Vibrio）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）分別含1个种;不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌属（Staphylococcus）分别含2个种;泛菌属（Pantoea）含3个种;芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌属含11个种占分离细菌的34.37%。从分离得到的海洋细菌中发现1株细菌的全长16S rRNA基因序列与其最近缘的典型菌株序列相似性低于97%，基于系统发育分析认为全长序列相似性低于98.65%的菌株代表潜在新属或新种（Kim et al.，2014）。IMDGX 6574与有效发表菌株Aurantimonas coralicida DSM （14790）T的最高相似性为94.65%，为潜在的新种或新属。

2.2 32株内生细菌在植物样品、植物组织及培养基中的分布

32株真红树内生细菌在14份植物样品、5种植物组织及9种分离培养基中的分布情况如图2、图3和图4所示。其中，图2样品H4（1号采样点的白骨壤）和H9（2号采样点木果楝）分离得到的菌株数量最多，其次是样品H2红海榄，分离得到12株细菌。从不同组织分离得到的细菌种属多样性与数量结果如图3所示，如从叶子获得的菌株数量最多（22株），相应地其种属多样性也最丰富（12个属），根中分离得到的菌株数量最少（6株），相应地其种属多样性也较少（3个属）。根据9种分离培养基的分离效果可知，图4中M7培养基（改良ISP5培养基）分离得到的菌株数量和多样性均最多，其主要营养成分为酵母粉与L-天冬酰胺;M10培养基（改良淀粉-水解酪素培养基）分离得到菌株数量和多样性较高;M9培养基（精氨酸-天冬酰胺培养基）分离得到菌株数量和多样性均最少。因此，M7（改良ISP5培养基）与M10（改良淀粉-水解酪素培养基）培养基可为今后分离纯化细菌工作提供培养基成分参考。

2.3 真红树植物内生细菌发酵产物延缓衰老活性分析

内生细菌的延缓衰老活性数据，采用 SPSS Statistics 17.0 软件进行分析，采用方差分析进行两两比较。由表4第一批研究结果可知编号IMDGX 6198寡养单胞菌属的Stenotrophomonas rhizophila与空白对照相比P<0.01，差异极显著，并且具有统计学意义。表5所示，第二批次样品中编号IMDGX 6121-1不动杆菌属的Acinetobacter soli与对照组比较（P<0.01），IMDGX 6355泛菌属的Pantoea anthophila与对照组比较（P<0.05）具有显著差异，能显著延长线虫寿命。

研究结果分析显示IMDGX 6198、IMDGX 6355和IMDGX 6121-1，3株真红树内生细菌能显著延缓线虫衰老，分别与相对应批次的空白组比较平均寿命可分别达到（19.62±1.04）、（19.63±6.72）和（22.70±0.94）d，最大寿命可达到21.68、21.37和24.57 d。据Huang et al.（2004）研究可知寿命长短是衰老过程研究中的一个主要依据，线虫的衰老过程伴随着生理功能的衰减。因此，研究线虫的寿命可评价微生物代谢产物的延缓衰老活性。

3 讨论与结论

随着普通环境下筛选新化合物的几率逐渐下降，人们开始把注意力转向了特殊生境的微生物资源（李文均等，2003）。海南西海岸红树林资源丰富、生长环境独特，同时也为其内生菌提供了特殊的生态环境。为丰富海南西海岸真红树内生细菌的多样性及生物活性，本研究选择14份真红树植物的46份组织样品，利用9种不同营养成分的分离培养基分离纯化其中的内生细菌，共分离培养内生细菌32株，隶属于12科17属，其中11株芽孢杆菌（Bacillus）（占34.37%），为优势菌群。

可见，芽孢杆菌在真红树内生微生物中占统治地位，这与李菲等（2017）研究结果相同。本研究从真红树植物的13份叶子中分离到22株内生细菌，数量最多，其次从14份茎中分离到17株，12份胚轴样品中得到15株，2份花中得到7株和5份根部位样品得到6株。叶子中分离得到的细菌种类最多，其次是茎和胚轴，花与根部位最少，此研究结果与其他学者相比较存在差异（陈振明等，2006;魏玉珍等，2010;李家怡等，2017）。推测原因可能是采样地点和季节、采集样品的老嫩程度和采集样品部位的数量、样品处理方式和外部环境所致。因此，海南西海岸同一种真红树内生细菌的分布及其生物学特性是否具有组织特异性，还需进一步深入探索。

利用秀丽隐杆线虫模型筛选内生细菌的延缓衰老活性。检测结果显示，3株真红树内生细菌Stenotrophomonas rhizophila、Pantoea anthophila和Acinetobacter soli皆具有显著延缓线虫衰老的活性，分别隶属于寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、泛菌属（Pantoea）和不动杆菌属（Acinetobacter）。活性菌株Stenotrophomonas rhizophila曾被报道从石油污染的土壤上分离得到（Kumar et al.，2015）。Acinetobacter soli能高效降解食物中的聚山梨酸酯（Nguyen，2018），该属细菌可分泌表面活性剂，能有效降解石油烃以降低石油烃的生物毒性（刘玉华等，2016）。由此可见，筛选到的两株活性菌株具有开发成为药物、保健食品及化工产品的潜力。在本次研究中，菌株Stenotrophomonas rhizophila从红海榄根（H2）、白骨壤茎（H4）、红树根（H12）、木榄胚轴（H13）中均分离得到，Pantoea anthophila于木果楝叶子（H9）中分离得到，Acinetobacter soli可从木果楝茎（H9）以及瓶花木胚轴（H10）中分离得到。由此可见，同一海域不同采集地点和不同植物组织均可分离到相同的菌株。

就新颖性而言，从海南西海岸桐花树叶子中发现1株Aurantimonas sp.的潜在新种，其与已发表的菌株Aurantimonas coralicida DSM 14790T（ATXK01000033）的16S rRNA基因序列相似性低于97.00%。因此，下一步将对潜在新菌开展多相分类鉴定及对3株具有延缓衰老活性的菌株进行发酵条件的优化，并分析其发酵代谢产物的化学组成及其抗衰老机理，以期为海洋延缓衰老药物的开发与利用奠定基础。

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（责任编辑 周翠鸣）