基于DNA条形码的白斑切叶蜂粉源植物种类及多样性分析

何 波,谷战英,李红英,黄敦元,3,*

1 重庆师范大学,媒介昆虫重庆市重点实验室,重庆动物生物学重点实验室,重庆 401331 2 中南林业科技大学, 经济林培育与保护教育部重点实验室,育种与栽培国家林业局重点实验室,长沙 410004 3 中国科学院动物研究所 动物进化和系统学重点实验室,北京 100101

近年来,由于气候变化和人为因素的影响,野生蜜蜂面临多种风险,致使传粉者的服务功能在全球许多地区严重下降[1- 5]。鉴于传粉蜜蜂在经济作物授粉和野生植物繁衍方面的重要性,研究人员逐渐重视并尝试保护这些野生蜜蜂资源[6- 8]。粉源植物的多样性和筑巢地点的适应性是影响野生蜜蜂物种多样性最主要的因素[9- 10]。粉源植物多样性通常使用野外观察的方法,但具有一定的局限性,例如对观察的时间和空间具有敏感性,并且在野外观察条件下传粉者的种类难以准确鉴别。

孢粉学(Palynology),作为一种基于形态学鉴定花粉种类的方法,促进了植物与传粉者相互作用机制方面的研究[11- 13]。但其需要相当的分类学技巧和经验[14],并且有些植物类群的花粉因缺乏显著的物种识别特征而难以区分,如：桔梗科(Campanulaceae)和唇形科(Lamiaceae)[15- 16]。随着DNA条形码的发展,研究人员开始利用该方法来识别蜜蜂蜂粮中含有的植物种类[14, 17- 19]。Hawkins等[20]指出,与孢粉学相比,DNA条形码可以更精确更迅速地鉴定出蜂粮中的物种组成,且不需要深厚的分类学研究基础。

白斑切叶蜂(Megachilestrupigera)广泛分布于中国南方地区,是野生植物及农林作物的重要传粉昆虫之一[21]。该蜂在江西地区1年2代,可在芦苇管制作的人工巢箱内进行筑巢,并在其内制作蜂粮来繁育后代[22]。本研究使用芦苇管制作的人工巢管收集白斑切叶蜂,通过分子克隆并结合DNA条形码技术鉴别蜂粮中的物种组成,以揭示不同样地白斑切叶蜂粉源植物种类及多样性,为该蜂的保护和可持续利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究样地概况

本研究在江西省选择4种不同地貌类型的林地(图1)。其中,新余市水北镇(XYSB)和吉安市戈坪乡(JAGP)地处中亚热带地区,年均温度19.1℃,这两个样地均为山地丘陵,森林植被类型以杉木(Cunninghamialanceolata)、湿地松(Pinuselliottii)和油茶(Camelliaoleifera)等人工林为主。赣州市沙地镇(GZSD),地属低海拔丘陵,年平均气温为19.1℃至20.4℃；该样地以马尾松(Pinusmassoniana)为主,林下杂灌密集并零星种植部分幼龄油茶。赣州市齐云山自然保护区(GZQYS),位于赣州市崇义县西北边缘地带,地处罗霄山脉的南端,年平均气温17℃,属湿润型季风气候带,常年温暖湿润,雨量充沛；植被类型以常绿阔叶林为主,部分针叶树种为辅的混交林。

1.2 样品采集及DNA提取

根据白斑切叶蜂2个世代的主要发生时期(7月上旬和8月中旬),野外收集该蜂的筑巢巢管,并带回实验室解剖,置于-30℃下保存备用(图1)。同时,对4个样地每个巢箱周围2 km为半径范围内[23]的所有开花植物进行采集,共收集到开花植物81种,用于建立专用的植物DNA参考数据库(相关DNA序列已上传至NCBI数据库)。

蜂粮DNA提取前先将每个样地单个时期采集的蜂粮混合成一个样本,共得到8份含有花粉混合物的样本。将每份样本加入液氮,研磨时充分混匀,取100 mg用于DNA的提取。植物DNA提取使用新鲜叶片100 mg经液氮研磨后用于DNA的提取。实验具体步骤参照QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit中的使用手册。

1.3 PCR扩增和测序

开花植物和蜂粮分别进行rbcL、trnH-psbA和ITS2基因序列的扩增。rbcL扩增引物为：rbcLa_For(5′-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC- 3′)和rbcLa_Rev(5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG- 3′)；trnH-psbA扩增引物为：psbA3(5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC- 3′)和trnH05(5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC- 3′)；ITS2扩增引物为：ITS2_S2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT- 3′)和ITS2_S3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3′)。PCR反应体系(25 μL)：上下游引物各1 μL(10 μmol/L),DNA模板1 μL(50—100 ng),ddH2O 12.75 μL,dNTP 4 μL,10×LA PCR Buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,TaKaRa LA Taq酶(5 U/μL)0.25 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s,52℃退火45 s,72℃延伸1 min,共35个循环；最后72℃延伸4 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物送北京中科希林生物有限公司进行纯化、克隆及测序。其中,植物叶片扩增产物直接测序,蜂粮扩增产物经克隆后,每个样本随机挑选100个单克隆用于测序。

1.4 数据分析

序列分析用软件Clustal W 2.1[24]进行多重序列比对,由Mothur version v.1.30[25]软件在99 %相似度下进行可操作分类单元(OTU)聚类,随后将OTU的代表序列与已建立的DNA条形码数据库进行比对和分类。最后,统计蜂粮中各样本在各个分类水平上的植物群落组成及丰度。

数据处理使用Excel 2007进行统计分析,利用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。运用R软件的spaa包和vagan包计算Shannon-wiener指数和Simpson指数；Mothur软件计算Chao1指数。统计图由Excel 2007和R软件绘制。

2 结果

2.1 序列拼接与组装

白斑切叶蜂在4个样地的2个主要发生时期共采集到29个筑巢的巢管,解剖后共获得124个含有蜂粮的虫室。从蜂粮的rbcL、trnH-psbA和ITS2基因测序中获得优质序列共2400条。在99%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTUs共120个(表1)。

表1 白斑切叶蜂蜂粮样品和测序的基本信息

OTU：操作分类单元Operational taxonomic unit；XYSB：新余市水北镇；JAGP：吉安市戈坪乡；GZSD：赣州市沙地镇；GZQYS：赣州市齐云山自然保护区

2.2 粉源植物DNA条形码鉴定

白斑切叶蜂蜂粮的OTU代表序列与专用的数据库比对结果表明：rbcL序列比对后通常会出现多个一致性高于99%的物种,而无法准确鉴定到种。例如,金毛耳草(Hedyotischrysotricha)和攀茎耳草(Hedyotisscandens)序列的一致性为100%。相反,trnH-psbA和ITS2序列虽然也有少数物种未被鉴定到种,但其鉴定成功率比rbcl更高。3个基因序列的鉴定准确率为ITS2>trnH-psbA>rbcL。然而,使用rbcL、trnH-psbA和ITS2序列综合分析,本实验中涉及到的OTUs代表序列均能与参考数据库中的开花植物物种序列相对应,物种划分准确率为100%,结果见表 2。

表2 OTUs代表序列与参考数据库的比对结果

rbcL：编码核酮糖- 1,5-二磷酸羧化/加氧酶的大亚基Ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenas；psbA-trnH：psbA基因和trnH基因的间隔区序列Intergenic spacer region oftrnHandpsbAgene；ITS2：内转录间隔区Internal transcribed spacer

2.3 粉源植物种类及丰度分析

基于OTUs的分类结果,对白斑切叶蜂蜂粮样本中粉源植物种类和相对丰度进行了统计分析(表1)。在科级分类阶元上,共注释到了菊科(Compositae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、藤黄科(Guttiferae)、豆科(Leguminosae)、唇形科(Labiatae)、马钱科(Loganiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、茜草科(Rubiaceae)和马鞭草科(Verbenaceae)共9个科,其中以马鞭草科植物为优势类群。在属级分类阶元上,共注释到了金合欢属(Acacia)、藿香蓟属(Ageratum)、鬼针草属(Bidens)、醉鱼草属(Buddleja)、耳草属(Hedyotis)、金丝桃属(Hypericum)、忍冬属(Lonicera)、鼠尾草属(Salvia)、黄花稔属(Sida)和黄荆属(Vitex)共10个属,其中以黄荆属植物为优势类群。在种级分类阶元上,共注释到了儿茶(Acaciacatechu)、金合欢(Acaciafarnesiana)、藤金合欢(Acaciasinuata)、藿香蓟(Ageratumconyzoides)、白花鬼针草(Bidensalbavar.radiata)、醉鱼草(Buddlejalindleyana)、清远耳草(Hedyotisassimilis)、金毛耳草(H.chrysotricha)、地耳草(Hypericumjaponicum)、忍冬(Lonicerajaponica)、蓝花鼠尾草(Salviafarinacea)、佛光草(Salviasubstolonifera)、黄花稔(Sidaacuta)、黄荆(Vitexnegundo)和山牡荆(Vitexquinata)共15个种。其中以黄荆和山牡荆为优势种,相对丰度分别为49.08%和30%。4个样地粉源植物种类之间有所不同,XYSB和JAGP均注释到5种植物,优势种均为黄荆(分别为69.8%和74%)；GZSD注释到9种植物,优势种为山牡荆(54.3%)；GZQYS注释到12种植物,优势种为山牡荆(45.8%)和黄荆(26.6%)。4个样地的共有优势种为黄荆(图2)。

图2 不同样地白斑切叶蜂粉源植物组成及相对丰度Fig.2 Composition and relative abundance of pollen plants of Megachile strupigera from different sample plots

2.4 粉源植物多样性分析

本研究选择Chaol、Shannon-wiener和Simpson指数对单个样本内植物种类的丰富度和多样性进行分析。Chaol指数反映样本中群落的丰富度,Shannon-wiener指数反映样本中群落的多样性,Simpson指数反映样本中优势种的集中程度。由表3可见,在七月上旬,GZSD和GZQYS的Chao1指数(分别为9.67±1.15和10.22±0.19)均显著高于XYSB和JAGP的Chao1指数(均为5±0.00)；八月中旬,JAGP的Chao1指数最低(为2±0.00),XYSB和GZSD的Chao1指数相同(为3±0.00),GZQYS最高(为4±0.00),表明GZQYS具有最高的物种丰富度。GZSD和GZQYS在七月上旬的Shannon-wiener指数(分别为2.14±0.17和2.41±0.18)均显著高于XYSB和JAGP的Shannon-wiener指数(分别为1.55±0.02和1.53±0.06)；八月中旬,GZQYS的Shannon-wiener指数(1.66±0.05)显著高于XYSB、JAGP和GZSD(分别为0.91±0.15、0.62±0.25和0.95±0.25),表明GZQYS的物种多样性最高。Simpson指数统计结果与Shannon-wiener指数统计的总体趋势成反比,表明GZQYS优势种的集中程度要高于XYSB、JAGP和GZSD。Choal指数和Shannon-wiener指数越大,Simpson指数越小,说明样本中的物种丰富度和多样性越高。因此,GZQYS粉源植物的丰富度和多样性最高,其次是GZSD,较低为XYSB,最低的是JAGP。并且,4个样地七月上旬的物种丰富度均明显要高于八月中旬。

表3 白斑切叶蜂粉源植物的多样性指数

表中数据为平均值±标准差；同列数据后相同的小写字母表示样本间差异不显著(P> 0.05)

3 讨论

DNA条形码能更精确更迅速的鉴定出蜂粮中的物种组成,且不需要深厚的分类学研究基础[17,20]。本研究运用该方法能有效鉴定出白斑切叶蜂蜂粮的植物群落组成。然而,不同基因序列的物种鉴定准确性差异较大。Bruni等[14]认为rbcL序列在蜂粮物种鉴定中的能力有限,而trnH-psbA是鉴定准确性相对较高的序列。Richardson等[26]认为ITS2序列在种内和种间变异大,物种正确鉴定率高,具有较高的通用性。本研究,rbcL、trnH-psbA和ITS2在单独进行物种鉴定时,部分物种不能准确鉴定到种。而采用rbcL+trnH-psbA+ITS2组合作为蜜蜂蜂粮的标准DNA条形码,能准确的鉴定蜜蜂蜂粮中植物物种的组成。

本研究使用了克隆测序的方法来获取样本序列,共注释到粉源植物15种,隶属于9科,10属。然而,白斑切叶蜂不同样地之间的粉源植物丰富度具有一定的差异,尤其是七月上旬GZSD和GZQYS两个样地具有显著高的物种丰富度。从Chao1指数分析中可以看出,GZSD和GZQYS样地中估算的物种数分别为9.67±1.15和10.22±0.19,而本研究实际观察到的物种数分别只有8和10种。4个样地不同时期的物种丰富度表明,物种注释数量的准确性随着物种丰富度的增加而降低,一些样本的实际物种数可能会被低估。另外,本研究并没有鉴定到何波等[22]之前在野外观察到的该蜂其他两种访花植物(红根草Lysimachiafortunei和二歧蓼Polygonumdichotomum)。因此,我们认为挑取100个单克隆还不足以完全反应出样本的实际物种数量,但这对其主要OTUs的丰富度和多样性影响不大。而高通量测序技术作为一种主流的研究方法,可更全面提高白斑切叶蜂粉源植物相对丰度的鉴定准确率。

传粉服务功能对生态系统的维持和稳定至关重要,而土地利用方式改变所引起的植物多样性丧失已成为传粉者多样性丧失的主要驱动力之一[27- 28]。蜜蜂作为传粉昆虫的重要组成部分,与植物多样性之间存在显著正相关关系[29- 32]。本研究发现不同林地利用方式对白斑切叶蜂粉源植物多样性的影响非常明显。XYSB和JAGP由于人为集约管理程度较高,人为干扰严重,导致粉源植物丰富度和多样性较低；GZSD由于林区无人管理,林内杂灌木较多,使粉源植物的丰富度和多样性较高；而GZQYS地处保护区内,人为干扰程度最低,粉源植物组成最为丰富。由此表明,土地利用方式是影响白斑切叶蜂粉源植物多样性的主要因素,这可能与人为干扰程度有关。

Requier等[33]研究发现：受当地植物生物多样性和季节性花期变化的影响,蜜蜂在不同时期或不同世代访花差异性显著。本研究通过对四种不同类型生境下白斑切叶蜂粉源植物组成进行分析,均显示2种黄荆属植物在该蜂蜂粮中的植物组成中占主导地位,其他植物数量较少。随着花期的变化和世代的交替,该蜂访花植物的种类呈降低的趋势。但是,四个样地不同时期的访花植物种类又存在一定的交叉,且其主要访花植物都为黄荆属植物,即该蜂主要粉源植物种类没有受到花期变化的影响。因此,我们认为黄荆和山牡荆是白斑切叶蜂主要的粉源植物,对维持白斑切叶蜂种群的稳定具有重要作用。