低温高湿解冻对南美白对虾保水性及肌原纤维蛋白生化特性的影响

崔 燕，朱 麟，尚海涛，宣晓婷，俞静芬，林旭东，康孟利，凌建刚,2，*

(1.宁波市农业科学研究院 农产品加工研究所， 浙江 宁波 315040；2.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院， 浙江 杭州 310058)

南美白对虾(Penaeusvannamei)，学名凡纳滨对虾，为我国重要经济虾类。冷冻是对虾主要贮藏、流通的方式，解冻是其加工、消费的必经环节，也是保证产品品质的关键过程。因此，为提高解冻效率并有效控制产品品质，选择合适的解冻方式至关重要。

目前，水、空气等传统解冻是家庭和工业生产中广泛使用的解冻方式，存在资源浪费、耗时、微生物增殖快或过程不可控等问题[1]。为克服传统解冻存在的问题，超高压[2]、低温高湿[3]等现代解冻技术不断涌现，其中低温高湿解冻技术在提高效率、保持品质的同时，兼备成本低、适用性强等优势，在解冻领域备受关注。研究发现，高湿利于解冻，4 ℃高湿环境中牛肉解冻速率是低湿环境的3倍[4]；与常规空气解冻相比，牛、鸡等畜禽肉品汁液、营养流失及蛋白质氧化程度显著降低，肉色、质构及肌肉微观结构保持良好[3,5-6]。同时，低温高湿解冻在彭泽鲫[7]、鲳鱼[8]等水产品中亦表现出明显优势。然而，目前低温高湿解冻技术在水产品领域应用研究的报道并不多，对南美白对虾解冻及其品质影响的研究也鲜有报道。

本文系统分析低温高湿与传统解冻对南美白对虾解冻效率及肌肉保水性、脂质氧化、肌原纤维蛋白生化特性等品质的影响，以期为低温高湿解冻技术在南美白对虾中的应用推广提供理论依据及技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活南美白对虾购于宁波路林水产交易市场(8月)，供氧条件下快速运往实验室，挑选个体、颜色、质量((13±1)g)相近的用于实验。Ca2+-ATPase试剂盒，南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

低温高湿解冻机，天津大远东制冷设备有限公司；RX4116ATN型温湿度记录仪，杭州美控自动化技术有限公司；TA.XT Plus型质构仪，英国Stable Micro Systems公司；CR- 5型色差仪，日本柯尼卡美能达公司；FE- 28型pH计，梅特勒- 托利多(上海)仪器公司；MS105DU型电子分析天平，Mettler Toledo仪器有限公司；752S型紫外- 可见分光光度计，上海棱光技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品处理

对虾冰水致死、洗净、沥干后，一部分作为新鲜对照组直接进行指标测定，其余真空包装(10只/包)后置于-80 ℃冰箱速冻，待中心温度达到-18 ℃后转移至-18 ℃冰箱冻藏备用。

样品随机分成7组(每组8包)，采用如下7种方式进行解冻，将温度传感器探头插入样品中心，实时监测中心温度变化，待中心温度达到0～2 ℃时视为解冻终点，记录解冻时间并进行指标测定。

1)低温高湿解冻(LT)：分别于-1～1 ℃(LT- 1- 1组)、2～4 ℃(LT2- 4组)、5～7 ℃(LT5- 7组)和8～10 ℃(LT8- 10组)，RH≥95%条件下进行解冻。

2)低温空气解冻(LAT)：4 ℃冰箱，RH为80%±2%条件下进行解冻。

3)自然空气解冻(NAT)：于周围没有热源的实验桌上进行解冻，空气温度为(25±1) ℃，RH为65%±2%。

4)静水解冻(WIT)：于(25±1) ℃水浴中进行解冻，虾与水的质量比约1∶5。

1.3.2保水性测定

以解冻、蒸煮、总汁液流失率及持水力评价肌肉保水性，测定参照文献[8]进行。总汁液流失率为解冻与蒸煮汁液流失率之和。

1.3.3色泽测定

对虾去壳并沿背部中线剖开，使用CR- 5型色差仪测定样品内部剖面的L*、a*、b*值，并计算其总色差(ΔE)，进行10次平行实验，ΔE计算见式(1)：

ΔE=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2。

(1)

式(1)中，ΔL*、Δa*、Δb*分别为处理组与新鲜对照组L*值、a*值、b*值之差。

1.3.4质构特性测定

采用TPA模式对虾仁(第二腹节)的硬度、弹性、咀嚼度和回复性进行测定。测试参数：P5探头，下行速度2 mm/s，下压和回升速度1 mm/s，下压深度5 mm，触发力0.05 N，停留间隔时间5 s。平行实验12次。

1.3.5pH值测定

参照《食品安全国家标准 食品pH值的测定》(GB/T 5009.237—2016)进行。

1.3.6硫代巴比妥酸值测定

参考Xuan等[9]方法，利用丙二醛(malondialdehyde，MDA)在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)发生显色反应的特性，测定对虾TBARS值。TBARS值以每千克样品中MDA的毫克数表示(mg/kg)。

1.3.7蛋白质指标测定

1.3.7.1 肌原纤维蛋白提取

参考文献[10]，4 ℃下进行提取，提取液分装于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3.7.2 总巯基含量测定

采用Ellman试剂法进行总巯基(total sulfhydryl，T- SH)含量测定[11]。吸取0.25 mL肌原纤维蛋白溶液与2.5 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(含8 mol/L尿素，pH值8.0)混合，加入50 μL 10 mmol/L 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，40 ℃水浴15 min，测定412 nm处吸光度。双缩脲法测定样品蛋白质质量浓度，使用摩尔消光系数13 600 L/(mol·cm)计算T- SH含量，结果表示为μmol/mg(以每毫克蛋白质计)。

1.3.7.3 羰基含量测定

羰基含量参考朱文慧等[12]方法进行。双缩脲法测定样品蛋白质质量浓度，使用摩尔消光系数22 000 L/(mol·cm)计算羰基含量，结果以nmol/mg表示，以每毫克蛋白质计。

1.3.7.4 表面疏水性测定

根据文献[13]对肌原纤维蛋白表面疏水性进行测定，其值以每毫克蛋白质所结合的溴酚蓝量表示(μg/mg)。

1.3.7.5 Ca2+-ATPase活性测定

按试剂盒说明进行测定，结果以每小时每毫克蛋白质中ATP酶分解ATP所释放的无机磷的量表示(μmol/(mg·h))。

1.4 数据分析

数据以平均值±标准差表示，应用SPSS 18.0软件以one-way ANOVA 法及Duncan检验进行组间比较和差异显著性分析，同时分析指标间相关性，P<0.05表示存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 解冻方式对南美白对虾解冻时间的影响

不同解冻方式的解冻时间差异见图1。静水解冻显著快于所有空气解冻(P<0.05)；与自然空气解冻相比，LT8- 10、LT5- 7、LT2- 4组解冻时间分别下降62.45%、39.11%和9.14%(P<0.05)；LT- 1- 1组解冻时间仅为低温空气解冻的59.80%，表明高湿利于解冻，可大幅提高解冻速率。这与高湿条件下水蒸气发生冷凝释放大量潜热，并在虾体表面不断形成水膜密切相关，因水的比热远大于空气，传热速率大幅提高，故能有效缩短解冻时间。这一发现与鲳鱼低温高湿解冻研究结果相似，相同温度下(4 ℃)，高湿条件解冻时间仅为低温空气解冻的68.01%[8]。

不同字母表示差异显著(P图1 不同解冻方法对南美白对虾解冻时间的影响Fig.1 Effects of different thawing methods on thawing time of Penaeus vannamei

2.2 解冻方式对南美白对虾肌肉保水性的影响

汁液流失率是衡量肌肉保水性的重要指标，影响产品质构和感官特性。速冻- 解冻过程造成了虾体汁液的严重流失(表1)，各组汁液流失率较新鲜对照组均显著上升(P<0.05)。较传统解冻，低温高湿可有效降低对虾在解冻过程中的汁液流失(P<0.05)，解冻汁液流失率较低温空气组下降19.95%～76.60%。这一结果与牛肉[5]、鲳鱼[8]等低温高湿解冻研究结果相似。对于蒸煮汁液流失率而言，低温高湿较传统解冻下降明显，其中LT- 1- 1组最低，为25.09%，显著低于传统解冻(P<0.05)。与传统解冻相比，低温高湿(-1～7 ℃)解冻的总汁液流失率显著下降(P<0.05)，下降程度随温度下降呈上升趋势。Li等[5]也发现，低温高湿解冻较低温空气解冻可显著降低牛肉的汁液流失。这可能是低温高湿条件下，虾体表面不断形成水膜，阻止水分散失并隔绝氧气，从而减缓生化反应、抑制腐败微生物滋生，加速细胞复水并维持肌细胞完整性和保水性，进而降低了解冻过程中汁液流失。

解冻后对虾的持水力发生了不同程度变化。静水、自然空气和LT8- 10解冻后，离心失水率显著增加(P<0.05)，其中自然空气解冻的持水力最差，这可能是解冻温度相对较高，蛋白酶活性较强，从而影响肌肉蛋白结构，造成持水能力下降。然而，低温高湿解冻组(-1～7 ℃)的离心失水率较静水、自然空气解冻明显下降(P<0.05)，甚至恢复至新鲜值水平，表明7 ℃及以下低温高湿解冻能有效减缓解冻过程造成的对虾肌肉持水力的降低。

综上表明，7 ℃及以下低温高湿解冻可有效减缓对虾保水性的下降，降低解冻过程中营养物质等的流失。

2.3 解冻方式对南美白对虾色泽的影响

解冻后对虾肌肉发白，各组L*值均呈显著上升趋势(P<0.05)，其中低温空气解冻组变化最大，见表2。各处理组a*值、b*值在解冻后均显著低于新鲜值(P<0.05)，肌肉颜色呈现向蓝绿色变化的趋势，且不同解冻方式对肌肉a*值、b*值的影响存在明显差异(P<0.05)，其中LT2- 4组的变化程度最小，色泽保持相对较好。但从ΔE数值看，除静水与低温空气解冻间存在显著差异外(P<0.05)，其他组别之间差异不显著(P>0.05)，表明不同解冻方式对虾仁色泽无明显影响。

表1 不同解冻方法对南美白对虾保水性的影响

不同字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

表2 不同解冻方法对南美白对虾色泽的影响

不同字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

2.4 解冻方式对南美白对虾质构的影响

对虾的硬度、弹性、咀嚼性及回复性在冷冻- 解冻后均显著下降(P<0.05)，见表3。这是因为冰晶对细胞的破坏导致了虾体变软，质构劣变。静水和自然空气解冻后，质构下降最为明显，这可能与其较高的解冻汁液流失率及离心失水率相关(表1)。低温高湿解冻后，各组的4项质构参数均显著高于静水解冻(P<0.05)，硬度和咀嚼性显著高于自然空气解冻(P<0.05)；LT2- 4组质构保持最佳，硬度和咀嚼性较传统解冻显著提高(P<0.05)，表明低温高湿解冻较3种传统解冻能延缓虾体质构参数的下降，质构特性得到较好保持。

表3 不同解冻方法对南美白对虾质构的影响

不同字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。

2.5 解冻方式对南美白对虾pH值的影响

pH值是衡量水产品品质变化的重要指标，亦是衡量肌肉蛋白功能性的一项重要指标。解冻后对虾pH值均呈现出明显上升趋势(P<0.05)，其中自然空气解冻组pH值增幅最大，见图2。这是因为其解冻温度较高且时间较长，蛋白酶活性较高且微生物繁殖加快，蛋白质被逐渐分解成氨基酸、氨及胺类等碱性物质，从而导致pH值明显上升。与传统空气解冻相比，低温高湿解冻组pH值均显著下降(P<0.05)，表明低温高湿有助于更好地保持对虾的新鲜度和品质，这可能是因为高湿条件下解冻时间相对较短，且水膜的形成可隔绝氧气，进而抑制生化反应及微生物滋生。

不同字母表示差异显著(P图2 不同解冻方法对南美白对虾pH值的影响Fig.2 Effects of different thawing methods on pH of Penaeus vannamei

2.6 解冻方式对南美白对虾脂质氧化的影响

TBARS值是判断脂肪氧化程度的重要指标，脂肪氧化产生的醛类物质(如MDA)是引起品质劣变的重要原因，国际推荐以1～2 mg/kg作为水产品脂肪氧化阈值[14-15]。解冻后各组TBARS值均未超过阈值，但与新鲜对照组相比，均发生了不同程度的上升，见图3。其中，低温空气解冻组脂质氧化程度最高，这与其较长的解冻时间密切相关(图1)；静水、自然空气解冻TBARS值较高则与其解冻温度较高相关。然而，低温高湿解冻下脂质氧化程度较3种传统解冻方式均显著下降(P<0.05)，其中LT- 1- 1组和LT8- 10组甚至降至新鲜值水平，这主要是由于虾体表面水膜的形成，降低了脂质与空气的接触机会，抑制脂质氧化反应发生。

不同字母表示差异显著(P图3 不同解冻方法对南美白对虾脂质氧化的影响Fig.3 Effects of different thawing methods on lipid oxidation of Penaeus vannamei

2.7 解冻方式对南美白对虾蛋白质氧化的影响

大量文献显示，水产品在冷冻- 解冻过程中会发生蛋白质氧化，从而导致品质劣变[16-17]。本实验中亦发现同样现象，对虾在不同方式解冻后肌原纤维蛋白发生了不同程度的氧化(图4)。对比各蛋白质氧化指标发现，3种传统解冻处理后T- SH含量明显下降(P<0.05)，而低温高湿解冻组T- SH含量虽有所下降，但与新鲜值无显著差异(P>0.05)；低温高湿解冻(-1～7 ℃)后，羰基含量有所上升，但上升程度显著低于静水和自然空气解冻组(P<0.05)，其中LT5- 7组羰基含量与新鲜值相当；LT2- 4和LT5- 7组表面疏水性显著低于3种传统解冻方式(P<0.05)，其中LT2- 4组水平与新鲜值相当。综合蛋白质氧化指标来看，7 ℃以下低温高湿解冻明显优于传统解冻，可显著降低解冻过程中肌原纤维蛋白氧化，这与鲳鱼低温高湿解冻中的发现一致[9]，高湿条件下解冻速率加快，从而缩短对虾在空气中的暴露时间，同时对虾表面形成水膜隔绝氧气，进而减少微生物滋生和生化反应，降低蛋白质分子解折叠，减少巯基、疏水基团等的暴露，从而抑制蛋白质氧化的发生。

不同字母表示差异显著(P图4 不同解冻方法对南美白对虾蛋白质氧化的影响Fig.4 Effects of different thawing methods on protein oxidation of Penaeus vannamei

2.8 解冻方式对南美白对虾Ca2+-ATPase的影响

不同解冻方式对应的Ca2+-ATPase活性如图5。低温高湿解冻组Ca2+-ATPase活性均显著高于传统解冻方式(P<0.05)，表明低温高湿解冻可有效降低解冻过程中蛋白质的变性程度。Ca2+-ATPase的活性主要来源于肌球蛋白的头部结构，Cao等[18]认为其活性的下降与肌球蛋白活性部位巯基的氧化密切相关。Reza等[19]认为冰晶机械作用引发肌球蛋白球状头部构象改变，致使疏水残基暴露，分子聚合，从而导致Ca2+-ATPase活性的下降。另有研究发现，Ca2+-ATPase活性的下降可能是由于肌肉保水能力下降，引发蛋白- 蛋白相互作用，导致蛋白质发生重组[20]。

不同字母表示差异显著(P图5 不同解冻方法对南美白对虾Ca2+-ATPase活性的影响Fig.5 Effects of different thawing methods on Ca2+-ATPase activity of Penaeus vanname

2.9 相关性分析

解冻后对虾19个指标的相关性分析如表4。解冻时间对保水性(蒸煮、总汁液流失率和离心失水率)、色泽(L*、a*、b*和ΔE)、氧化(TBARS值和T- SH含量)及变性(Ca2+-ATPase活性)指标有显著或极显著的影响。保水性指标与质构指标呈显著负相关，表明高保水性有助于对虾质构的保持，LT2- 4组解冻后质构保持较好可能与其较高的保水能力相关。TBARS值、羰基含量、表面疏水性与保水性指标呈极显著正相关(P<0.01)；T- SH值则与保水性指标呈极显著负相关(P<0.01)，表明脂质和蛋白质氧化与肌肉持水能力的下降密切相关，7 ℃以下低温高湿解冻组对虾保持较高保水性(表1)的部分原因是其较低的TBARS值、羰基含量、表面疏水性水平及较高的T- SH含量(图4)。Ca2+-ATPase活性则与保水性指标、TBARS值、羰基含量、表面疏水性呈极显著负相关(P<0.01)，与T- SH值呈极显著正相关(P<0.01)。对虾经传统方式解冻后Ca2+-ATPase活性较低，可能与其较低的保水能力，较高的脂质、巯基氧化程度，以及蛋白质构象变化等有关。

表4 解冻后南美白对虾各指标之间的相关性分析

*表示相关性显著(P<0.05)，**表示相关性极显著(P<0.01)。

3 结 论

解冻条件对南美白对虾品质有显著影响。传统解冻条件下，对虾汁液流失较大，解冻汁液流失尤为突出，虾肉脂质、蛋白质氧化及蛋白质变性严重。高湿可有效提高解冻速率，解冻时间较传统空气解冻明显缩短。-1～7 ℃高湿解冻后，对虾保水性较高，解冻汁液、总汁液流失率均显著低于传统解冻，蒸煮汁液流失率及离心失水率则显著低于静水、自然空气解冻；2～4 ℃高湿解冻下对虾质构保持最佳。相较于传统解冻，低温高湿解冻脂质、蛋白质氧化程度明显下降，TBARS值显著降低，T- SH水平显著升高；而羰基含量较静水、自然空气解冻显著下降，表面疏水性则显著低于自然空气解冻；且蛋白质变性程度较低，Ca2+-ATPase活性显著高于传统解冻。综合解冻效率及品质，低温高湿解冻在保证效率的同时能较好维持对虾的保水性，并有效延缓脂质氧化及肌原纤维蛋白氧化、变性，是一种高效、高品质的解冻方式，值得进一步深入研究。