水蛭分子鉴定方法的研究进展

卢富华 李明玥 魏妙洁 石林春 刘金欣

摘要 水蛭基原复杂、市场混乱、传统方法难以有效鉴别，临床用药的安全性无法保障。分子鉴定方法根据生物间的分子特征差异进行鉴定，不受自然环境、生长发育阶段等外部因素影响，具有快速、准确、客观的特点。目前应用于水蛭的分子鉴定方法有：基于核酸的RAPD技术、SSR技术、DNA条形码技术和基于蛋白质的SDS-PAGE技术、同工酶分析技术，本文在简述水蛭不同分子鉴定方法研究进展的基础上，对水蛭不同分子鉴定方法的技术和应用特点进行比较，最后对DNA宏条形码技术、Target-sequencing技术、电化学传感检测技术在水蛭混合物，特别是中成药中水蛭成分的鉴定进行展望，旨在为水蛭鉴定方法的深入研究提供参考和借鉴。

关键词 水蛭;混伪品;鉴定;分子鉴定;PCR;DNA条形码鉴定;蛋白质标记;下一代测序

Research Progress on Molecular Identification of Leech

LU Fuhua， LI Mingyue， WEI Miaojie， SHI Linchun， LIU Jinxin

（Engineering Center of Traditional Chinese Medicine Resources of Ministry of Education; Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100193， China）

Abstract The origin of leech is complex， and its market is mixed and difficult for identification.The safety of clinical medication cannot be guaranteed.The molecular identification method is based on the difference of molecular characteristics between organisms， which is not affected by external factors such as natural environment， growth and development stage etc.And it has the characteristics of rapidity， accuracy and objectivity.At present， the molecular identification methods used in leeches are as follows：RAPD technique based on nucleic acid， SSR technique， DNA barcode technique， protein based SDS-PAGE technique， and isozyme analysis technique.Based on the research progress of different molecular identification methods of leeches， this paper compared the characteristics of their technology and application features.Finally， the method of combining DNA metabarcoding technique， target sequencing technique and electrochemical sensing detecting technique were predicted to be a potential method to identify leech components in the leech mixture or in the Chinese patent medicine， providing reference for the further study of the molecular identification methods of leeches.

Keywords Leech; Mixed artifacts; Identification; Molecular identification; PCR; DNA barcoding identification; Protein labeling; Next-generation sequencing

中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.003

水蛭始载于《神农本草经》[1]，是我国传统的活血化瘀药。2015年版《中华人民共和国药典》规定水蛭药材为水蛭科动物蚂蟥（宽体金线蛭）Whitmania pigra Whitman、水蛭（日本医蛭）Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥（尖细金线蛭）Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，具有破血通经，逐瘀消癥的功能，主治血瘀经闭，癥瘕痞块、中风偏瘫、跌打损伤[2]。水蛭中含有多种抗凝剂，已发现的可直接作用于凝血系统的成分有水蛭素、吻蛭素、类肝素、组胺等[3]。现代药理研究表明水蛭在防治动脉粥样硬化、抗凝血、抑制血栓、抗肿瘤等方面具有良好的疗效[4-8]。近年来，我国以水蛭为原料药材的中成药有90余种[9-10]，其中通心络胶囊、脑血康滴丸、脑心通胶囊等中成药被纳入2019年的《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》[11]。近年来，水蛭市场需求锐增、生态环境不断恶化、群众滥捕滥捉使得水蛭野生资源大幅减少，水蛭价格显著上涨[12-13]，不法商贩常使用混伪品、肚内填充异物、加明矾腌渍、加盐增重等掺假手段来谋利[14]，亟需建立准确有效的水蛭药材真伪鉴别方法，为水蛭药材的临床用药安全与疗效提供有力保障。

传统鉴定方法因受到遗传可变性[15]、表形可塑性[16]、化学成分复杂性[17]的影响，常常具有一定的局限性。20世纪70年代末期以来，随着分子生物学和信息学的快速发展，产生了更加直接、准确的分子鉴定方法。1980年，Botsein等[18]提出限制性内切酶片段长度多态性技术（RFLP），其基本原理是基因组经限制性内切酶消化后，通过Southern印迹和特定序列探针杂交后显示出遗传位点的等位变异，结果稳定可靠，但操作复杂、耗时较长，实践中常使用与聚合酶链式反应技术（PCR）结合的PCR-RFLP技术进行鉴定。期间，蛋白质电泳分离技术[19]被广泛应用于分子诊断。1990年，Williams等[20]提出以PCR为基础的随机扩增多态性DNA标记（RAPD）技术，但扩增结果的稳定性较差。简单重复序列标记（SSR）通过设计的引物进行扩增，快速稳定，且多态性较高，呈共显性遗传，被广泛用于种质鉴定[21]。1993年，Zabeau Mare和Vos Pieter[22]发明了扩增片段长度多态性技术（AFLP），其基本原理是对基因组酶切片段进行选择性扩增。1991年，香港中文大学邵鹏柱团队[23]运用了RAPD和随机引物PCR技术（AP-PCR）在人参与西洋参中进行DNA指纹鉴别，发表了第一篇中药分子鉴定英文论文。1994年，Zietkiewicz等[24]提出了简单序列重复区间扩增多态性技术（ISSR）。目前，2010年版《中华人民共和国药典》[25]收载了蕲蛇、乌梢蛇的PCR鉴定方法，2015年版《中华人民共和国药典》增补本已公示金钱白花蛇的快速PCR鉴定方法[2]。此外，川贝母的PCR-RFLP鉴定方法也被纳入了2015年版《中华人民共和国药典》[2]。

2003年，Hebert等[26]首次提出DNA条形码技术，这是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来鉴定物种的一种分子生物学技术，不受经验限制与环境影响，已成功应用于僵蚕[27]、水牛角[28]、金钱白花蛇[29]、哈蟆油[30]等动物药材鉴定研究。2014年，石林春等[31]构建了包含800余种动物药材及其混伪品和密切相关物种的“中国动物药材DNA条形码数据库”。许多优秀的中药分子鉴定专著也先后出版，如《中药DNA条形码分子鉴定》[32]《中国药典中药材DNA条形码标准序列》[33]等。2010年版《中华人民共和国药典》增补本正式收载中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则[25]，标志着中药分子鉴定成为继四大经典方法之后的新鉴定方法。随着高通量测序技术的飞速发展，更多的基因信息可被获得，基因信息的开发、利用以及基因信息库的构建使得分子鉴定技术全面推广。2018年，陈士林等出版了“十三五”规划教材《本草基因组学》专著[34]，引领现代组学技术在中医药研究中的应用，也为中药分子鉴定提供更多的资源。

水蛭的分子鉴定方法随着中药分子鉴定技术的进步而不断发展，见图1。本文将从DNA分子鉴定和蛋白质标记技术两大类简述近年来水蛭分子鉴定方法的研究进展，分析总结不同分子鉴定技术在水蛭药材真伪鉴定中的应用特点，旨在为今后水蛭分子鉴定方法的深入研究提供参考和借鉴。

1 DNA分子鉴定

DNA分子鉴定技术[35]是从核酸层面对中药材进行快速、准确的鉴定，包括基于PCR的分子鉴定技术以及DNA条形码技术，其中DNA条形码鉴定技术应用最为广泛。

1.1 基于PCR的分子鉴定技术

直接PCR技术[36]以微量组织样品的裂解物为DNA模板，借助灵敏、抗干扰能力强的Taq DNA聚合酶进PCR扩增。SNP分子标记能够为品种鉴定提供准确、快速的检测渠道[37]。在水蛭鉴定中，常用的PCR分子鉴定技术有简单序列重复区间扩增多态（ISSR）、相关序列扩增多态性（SRAP）、随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、简单重复序列标记（SSR）。Liu等[38]采集了全国蚂蟥分布区的八个省份的样本，用ISSR和SRAP对遗传多样性在物种水平上进行研究，SRAP与ISSR结果较为一致，聚類分析表明蚂蟥种群间有较高水平的遗传分化。与SRAP相比，ISSR的显性表现及通用性会更好，稳定性高，且无需预先克隆和测序，但ISSR准确性稍弱。刘飞等[39]采集了225个蚂蟥样本，利用RAPD进行遗传多样性分析，聚类分析结果表明在物种水平上群体间分化较大，种群内存在一定程度变异，与Liu等结果较为一致。刘飞等[39]还对蚂蟥进行了SSR开发，利用和生物素特异性结合、限制性内切酶消化的2种策略建立SSR文库，结果2种方法都可高效开发出SSR序列。

1.2 DNA条形码鉴定技术

DNA条形码鉴定技术是通过利用标准DNA片段对物种进行鉴定的方法。中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则提出动物类药材采用细胞色素c氧化酶亚基I（COI）序列为主，转录间隔区间2（ITS2）为辅的中药材鉴定体系[2]。据文献报道[40-41]，在应用DNA分子标记技术对水蛭鉴定时，常用COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA等分类序列，其中COI是进化较快的序列。

Elizabeth等[42-43]针对蛭纲53个物种进行了COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA序列分析，得到系统进化分类结果与传统的分类学结果不完全一致，认为有3个物种应归为医蛭科，欧洲山蛭的3个新物种实际可能是南美洲山蛭的入侵物种。刘飞等[44]对宽体金线蛭及水蛭的DNA序列进行ITS测序分析，结果也发现系统分类结果与分类学结果不完全一致，与Elizabeth等的结果相似，究其原因可能是ITS序列在进化时发生了碱基间的转换、颠换和缺失等少量位点变异。同年，Lai Y T.等[45]对台湾的几个黄蛭科新种利用COI、12S rRNA、16S rRNA的部分片段对进行分析，结果可成功实现种类鉴定。此后，刘晓帆[46-47]采集的12个水蛭样品（蚂蟥、水蛭、柳叶蚂蟥与其混伪品菲牛蛭、天目山蛭等）在条形码长度及GC含量上均有差异，在N-J遗传树中水蛭正品来源与各种混伪品不聚集在一起，可将水蛭药材与混伪品区分，菲牛蛭与水蛭十分相近，但还是各自分成独立的一支。说明各物种相互之间可明显区分，因此得出基于COI序列的DNA条形码技术适用于药材水蛭的鉴定。徐云玲等[48-50]增加了与刘晓帆等不同物种的水蛭（光润金线蛭、八目石蛭），对COI、12S和16S基因进行测序来构建分子系统树，发现每种水蛭均形成独立分支，成功将这6种水蛭进行鉴定分类，也得出了与此前研究相同的结果。肖凌[51]对宽体金线蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭、光润金线蛭、日本山蛭及八目石蛭共8个物种进行鉴定，比之前的研究又增加了新物种与新基因片段序列（ITS2、COI、12S rRNA、16S rRNA等），考察序列种间、种内变异的Barcoding Gap，最后也得出相同结论，还提出了可将12S rRNA作为医用蛭类较为合适的DNA条形码序列。综上所述，应用COI及12S rRNA联合序列在种内保守、种间差异较大的片段设计特异引物可准确鉴别水蛭药材与混伪品。

2 蛋白质标记技术

蛋白质标记技术[52]是从蛋白质层面对中药材进行快速、准确的鉴定，包括抗血清鉴定技术、蛋白质电泳鉴定技术、同工酶鉴定技术以及蛋白飞行时间质谱鉴定技术，但将抗血清鉴定技术运用于水蛭鉴定还需进行进一步研究探索。

2.1 蛋白质电泳鉴定技术

蛋白质电泳鉴定技术[52]是依据中药中所含蛋白质分子的大小、形状或所带电荷差异，采用电泳分离来鉴定中药的方法，常用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和毛细管电泳（CE）。丁月珠[53]对蚂蟥清水吊干品、菲牛蛭干品、菲牛蛭鲜品采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法检测3种水蛭样品对纤维蛋白原的作用，结果发现蚂蟥清水吊干品对纤维蛋白原有水解作用，尤其是对α、β链的作用较强，而菲牛蛭干品与菲牛蛭鲜品对纤维蛋白原均无此作用。因此，SDS-PAGE法可将蚂蟥与菲牛蛭成功鉴别。

2.2 同工酶鉴定技术

同工酶鉴定技术[52]是依据待鉴定中药中同工酶的分子结构、活性以及免疫原性等的特异性，使用酶活性分析、电泳检测等技术来鉴定中药品种的方法。罗媛媛等[54]对日本医蛭和天目山蛭的4种同工酶（ES、MDH、POX、LDH）采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠电泳进行比较研究，结果显示4种同工酶在日本医蛭和天目山蛭中的表达程度和LDH同工酶谱对比具有相似性，说明日本医蛭和天目山蛭在遗传上具有一定相似性，可能存在一定亲缘关系。这与分类学结果相吻合，其同属于无吻蛭目医蛭形亚目。

2.3 蛋白飞行时间质谱技术

蛋白飞行时间质谱鉴定技术[52]采用了飞行时间质谱与荧光标记技术对中药中所含肽和蛋白质种类组成进行分析来鉴定中药的方法，可建立出动物类中药蛋白或肽成分的质量指纹图谱，在羚羊角[55]、阿胶[56]、地龙[57]等药中已成功应用。Baskova[58]利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱对水蛭唾液腺分泌物蛋白做分析，从而辨析出几种水蛭蛋白的组成异同，实现在蛋白质水平上的高效、高通量分离鉴定。此方面的实验[59-61]应用在水蛭中大多是采用电感耦合等离子质谱（ICP-MS）或质谱技术对水蛭药材重金属元素进行检测研究，在使用蛋白飞行时间质谱鉴定技术对水蛭进行鉴定还需进一步探索研究。

3 讨论

3.1 水蛭市场现状

2015年版《中华人民共和国药典》规定的中药材水蛭的基原物种为水蛭科动物蚂蟥、水蛭或柳叶蚂蟥，然而市场常见品种主要为宽体金线蛭，日本医蛭数量极少，甚出现大量非药典规定的水蛭品种制作的水蛭药材，如牛蛭属的菲牛蛭、湖北牛蛭等[62]。中药材水蛭市场比较混乱，其原因是多方面的：一是各地用药习惯的差异。由于南北差异较大，各地用药习惯有着显著区别。菲牛蛭是西南水蛭的代表品种，被收录进2005年版《广西中药材标准》[63]与2005年版《云南省中药材标准》[64]，它符合部分地方用药标准，但却不满足2015年版《中华人民共和国药典》的规定。二是同科属的水蛭品种性状上的相似性常造成误用现象。常规性状鉴定只能区分到科级别，若需定种，则须观察环节数、生殖孔等细微特征，然而在加工成药材的过程中，这些细微的特征常遭到破坏，大大增加了性状鉴定的难度。并且水蛭的性状会受到外界环境变化的影响，不同地区的水蛭在大小，性状上也存在着细微差别，这些都对水蛭药材的常规鉴定提出了挑战。水蛭药材及其各种混伪品的粉末在显微镜观察下差异较小[42]，无法通过显微鉴定辨别真伪。而在药材薄层鉴定中，可能是由成分含量的差异不明显，正品和伪品与标准药材在相同位置形成相同颜色的点[30]，无鉴别意义。三是水蛭药材品种的历史遗留问题。关于水蛭的药用品种始终存在争议。通过本草考证，我们可以发现各古籍文献中对于水蛭的药用品种描述均不够详细，只是简单地强调了一下水蛭的药用品种不包括石蛭、泥蛭、山蛭及其诸小者，并且药用水蛭以“小者为佳”，并不涉及水蛭药用品种的具体形态特征的描述，如《蜀本草》[65]记载：“勿误采石蛭、泥蛭用。石、泥二蛭，头尖，腰粗，色赤，不入药，误食之，则令人眼中如生烟，渐至枯损”。关于水蛭的药用品种始终存在争议，一些文章也对水蛭在药典中规定的品种提出了增补修改建议[66]。四是供需缺口的扩大致使不法商贩掺假混用。由于近年来水蛭市场需求不断扩大，然而现有药用品种的水蛭野生资源大幅减产，且相关人工养殖技术仍不够成熟，无法供应水蛭药材需求，造成药材价格连年上涨，不法商贩因此打着进口水蛭药材品种[67]的幌子贩卖非药用品种的水蛭药材。其中，由于海南菲牛蛭资源较多，且菲牛蛭干品具有明显的抗凝抗血栓活性[68]，常被掺入混用。

3.2 分子鉴定技术在水蛭鉴定中的特点

基于PCR的分子鉴定技术具有多样性[69]，最大的特点是以微量样品为起始材料，高效扩增物种基因片段，可显著提高工作效率。当有大量样品需要处理时，这一优势则更为明显，刘飞等[39]基于此种方法对225个蚂蟥样本进行遗传多样性分析就大大节省了时间和人力。DNA条形码鉴定技术不受形态特征和生物个体发育的限制，且检测样本范围广，易于实现自动化和标准化，在中药水蛭鉴定中已经表现出巨大的应用潜力，基于COI序列的DNA条形码技术可很好地鉴别水蛭、宽体金线蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、日本山蛭、八目石蛭等物种，高效、准确。由于COI序列长度较长（658 bp），传统DNA条形码技术对DNA严重降解样品和混合样品的鉴定较为困难，需要借助Mini-barcode技术[70]或联合高通量测序技术进行鉴定。在蛋白质标记技术中，已有研究表明：SDS-PAGE法可鉴别蚂蟥与菲牛蛭;同工酶鉴定技术可鉴定分离日本医蛭和天目山蛭;表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术可实现了对几种水蛭蛋白的分离鉴定。因此，蛋白质标记技术在中药水蛭鉴定中也发挥重要作用。随着计算机科学、生物学以及操作技术的不断更新，中药鉴定实现了标准化和数字化，中药水蛭的鉴定方法在分子鉴定技术中也得到了进一步发展与完善，各项分子鉴定技术也有其优点与局限性，根据不同的特点可鉴定不同的水蛭品种，可见表1。

3.3 总结与展望

在传统物种分类基础上，结合基因分子水平进行系统发育、遗传进化、系统分类等方面的研究，寻找不同物种间基因分子水平的差异，使得水蛭鉴定方法更加具有科学性与多样性，DNA条形码鉴定技术具有广阔的应用前景。近年来，电化学传感检测技术备受关注，基于DNA测序、DNA/蛋白质相互作用以及生物分子检测等，灵敏度高、操作简单，目前该技术已应用在了鱼类HIV病毒检测方法构建[71]、甘草提取液中大肠杆菌的快检[72]，将该技术与纳米技术结合成功实现将西红花与它的6种掺假药精确鉴别[73]。宏条形码技术（DNA Metabarcoding）结合了DNA条形码和高通量测序技术可以对混合样本中所有物种的DNA片段进行同时检测，Jia等[74]基于ITS2和psbA-trnH片段，以单分子实时测序技术（SMRT）对中成药益母丸的成分进行有效检测鉴定。Xin等[75]结合了宏条形码技术和SMRT技术对中成药九味羌活丸进行物种鉴定，结果可高效、灵敏地检测九味羌活丸中各原药材的基原。石林春等[76]利用宏条形码技术对中成药如意金黄散中的原料药材进行了物种基原识别鉴定，结果除厚朴外的全部处方成分均可被检测到，鉴定出掺杂了混伪品朝鲜苍术和虎掌南星。Shotgun metagenomics技术可以克服宏条形码技术对PCR扩增成功率的依赖，Xin等[77]对市售中成药龙胆泻肝丸采用了Shotgun metagenomic sequencing进行鉴定，发现其中含有木通的混伪品。目标测序技术（Target Sequencing）信息量大，可以完整覆盖整个基因区域，获得高频SNP分型数据，对于低频的和个体特有的变异也能够识别，已成功应用在了271个商业辣椒品种多态性的检测鉴定[78]。可以预见，这些新技术可应用在中成药中水蛭成分的鉴定，对中药水蛭鉴定技术的发展起到推动作用，使鉴定结果更加合理准确，保障中药水蛭在临床中的有效应用。

参考文献

[1]佚名.神农本草经[M].顾观光，杨鹏举校注.北京：学苑出版社，2008：300.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015：83-84.

[3]李国强，李韵仪，李桃，等.水蛭的化学成分研究[J].天津中医药，2018，35（9）：703-705.

[4]韩文博，孙爱军，孟丽君，等.水蛭抗动脉粥样硬化作用研究进展[J].天津中医药，2019，36（7）：724-727.

[5]黄秋阳，冷静，甘奇超，等.水蛭及其制剂在心脑血管疾病中的应用[J].中成药，2019，41（8）：1915-1920.

[6]岳昆，曾祥雨，张洪霞，等.水蛭治疗下肢闭塞性动脉硬化症的研究进展[J].中国中医药现代远程教育，2019，17（7）：127-129.

[7]曾洁，麦荣云，阮景晟，等.基于网络药理学的含水蛭经方抗肿瘤机制研究[J].广西医学，2019，41（4）：467-472.

[8]Liu Xuan，Wang Caihui，Ding Xue，et al.A novel selective inhibitor to thrombin-induced platelet aggregation purified from the leech Whitmania pigra[J].Biochemical and biophysical research communications，2016，473（1）：349-354.

[9]李小芳.脉血康胶囊治疗短暂性脑缺血发作44例[J].现代中医药，2019，39（4）：57-59.

[10]毛亚妮，刘杲.通心络胶囊治疗心绞痛患者的临床观察[J].世界中西医结合杂志，2019，14（7）：970-973.

[11]医疗保障局，人力资源和社会保障部.国家基本国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录[S].2019-08-20.

[12]陈珊珊.水蛭养殖前景分析[J].现代农村科技，2018，37（3）：44.

[13]丁立威.水蛭产供销趋势分析[J].中国现代中药，2013，15（9）：808-811.

[14]识别真伪水蛭[J].中国中医药现代远程教育，2014，12（17）：128.

[15]康晓龙，冯登侦.DNA条形码及其在动物遗传多样性中的应用[J].畜牧与兽医，2012，44（6）：94-97.

[16]朱熠鹏.基于AFLP标记的农作物品种分子条码构建[D].杭州：浙江大学，2008.

[17]张凤.五种药用植物的化学成分研究[D].上海：第二军医大学，2011.

[18]Biswas R，Biswas K，Kapoor A.Authentication of Herbal Medicinal Plant-Boerhavia diffusa L.Using PCR-RFLP[J].Curr Trends Biotechnol Pharm，2013，7（3）：725-731.

[19]賀新军.蛋白质电泳谱的同位素标记与分析[J].生物化学与生物物理进展，1985，12（6）：39-43.

[20]Williams J G，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Res，1990，18（22）：6531-6535.

[21]王刚，曹佩，韦学敏，等.分子标记技术在药用植物种质资源研究中的应用[J].中国现代中药，2019，21（11）：1435-1444.

[22]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res，1995，23（21）：4407-4414.

[23]Michael Heinrich.Authentication of Chinese Medicinal Materials by DNA Technology[J].Journal of Ethnopharmacology，2003，88（2）：297-298.

[24]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20（2）：176-183.

[25]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2011.

[26]Hebert Paul D N，Cywinska Alina，Ball Shelley L，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc BiolSci，2003，270（1512）：313-321.

[27]贾静，石林春，姚辉，等.市售动物药材僵蚕的DNA条形码鉴定研究[J].药学学报，2016，51（11）：1784-1790.

[28]刘旭朝，周丽思，刘金欣，等.基于COI序列的水牛角及其易混伪品DNA条形码鉴定研究[J].药学学报，2017，52（3）：494-499.

[29]石林春，唐先明，胡志刚，等.基于DNA条形码技术的毒性药材金钱白花蛇药源调查[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（18）：16-22.

[30]石林春，刘金欣，唐先明，等.哈蟆油基原考证及DNA条形码物种鉴定研究[J].中国科学：生命科学，2019，49（8）：1032-1040.

[31]石林春，姚辉，谢丽芳，等.中国动物药材DNA条形码数据库[J].中国中药杂志，2014，39（12）：2155-2159.

[32]陈士林.中药DNA条形码分子鉴定[M].北京：人民卫生出版社，2012.

[33]陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列[M].北京：科学出版社，2015.

[34]陈士林.本草基因组学[M].北京：科学出版社，2018.

[35]方强强，王燕，彭春，等.中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（22）：197-205.

[36]Hwang H，Bae SC，Lee S，et al.A rapid and simple genotyping method for various plants by Direct-PCR[J].Plant Breed Biotechnol，2013，1：290-297.

[37]吴文如.分子生药学：中药分子鉴定[C].中国中医科学院中药资源中心.第八届分子生药学暑期研讨会暨中国中西医结合学会分子生药学专业委员会2019年学术年会资料汇编.中国中医科学院中药资源中心：中国中西医结合学会，2019：52-57，51.

[38]Liu F，Guo Q S，Shi H Z，et al.Genetic diversity and phylogenetic relationships among and within populations of Whitmania pigra and Hirudo nipponica based on ISSR and SRAP markers[J].Biochemical Systematic and Ecology，2013，51（4）：215-223.

[39]劉飞.蚂蟥生长繁殖习性及其遗传多样性分子标记研究[D].南京：南京农业大学，2008.

[40]Bely A，Weisblat D A.Lessons from leeches：a call for DNA barcoding in the lab[J].Evolution and Development，2006，8（6）：491-501.

[41]张辉.基于COI序列的DNA条形码在药典动物药品种鉴定中的应用[C].中国药学会中药和天然药专业委员会.中药与天然药高峰论坛暨第十二届全国中药和天然药物学术研讨会论文集.中国药学会中药和天然药专业委员会：中国药学会，2012：81-89.

[42]Elizabeth Borda，Mark E Siddall.Arhynchobdellida（Annelida：Oligochaeta：Hirudinida）：phylogenetic relationships and evolution[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，30（1）：213-225.

[43]Elizabeth Borda，Alejandro Oceguera-Figueroa，Mark E.Siddall.On the classification，evolution and biogeography of terrestrial haemadipsoid leeches（Hirudinida：Arhynchobdellida：Hirudiniformes）[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2007，46（1）：142-154.

[44]刘飞，郭巧生，史红专，等.蚂蟥和水蛭种间遗传变异和系统关系的ITS序列分析[J].中国中药杂志，2011，36（4）：414-419.

[45]Lai Y T.，NakanoT.，Chen J H.Three species of land leeches from Taiwan，Haemadipsa rjukjuana comb.n.a，new record for Haemadipsa picta Moore，and an updated description of Tritetrabdella taiwana（Oka）[J].Zookeys.2011，139：1-22.

[46]刘晓帆.龟甲、水蛭的品种与质量研究[D].北京：北京中医药大学，2013.

[47]刘晓帆，刘春生，杨瑶珺，等.基于COI基因的水蛭及其混伪品的DNA条形码研究[J].北京中医药大学学报，2013，36（1）：63-66.

[48]徐云玲.无吻蛭目五种水蛭线粒体基因组注释分析[D].武汉：湖北中医药大学，2013.

[49]徐云玲，聂晶，肖凌.6种水蛭的COI、12S rRNA和16S rRNA基因及分子进化分析[J].生物学杂志，2013，30（6）：10-13.

[50]Xu Y L，Nie J，Hou J J，et al.Complete mitochondrial genome of Hirudo nipponia（Annelida，Hirudinea）[J].Mitochondrial DNA，2016，27（1）：257-258.

[51]肖凌.水蛭DNA鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究[D].武汉：湖北中医药大学，2015.

[52]陈士林，郭宝林，张贵君，等.中药鉴定学新技术新方法研究进展[J].中国中药杂志，2012，37（8）：1043-1055.

[53]丁月珠.水蛭酶解物抗凝活性肽类成分及水蛭抗凝作用机制的研究[D].北京：北京中医药大学，2017.

[54]罗媛媛，姜乃澄.日本医蛭和天目山蛭4种同工酶的比较研究[J].浙江大学学报：理学版，2002，29（1）：99-102.

[55]张烨，王若光，王陆颖，等.以蛋白质芯片为中药蛋白质/肽相互作用载体分析羚羊角的生物学特征[J].湖南中医药大学学报，2009，29（6）：15-18.

[56]王若光，尤昭玲，刘小丽，等.基于激光解析/离子化-飞行时间质谱技术的中药阿胶蛋白质组分析[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（13）：2518-2521.

[57]王若光，李春梅，王陆颖，等.以蛋白质芯片为中药蛋白质/肽相互作用载体分析中药地龙生干品和炮制品的生物学特征[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（13）：2489-2492.

[58]I.P.Baskova，E.S.Kostrjukova，M.A.Vlasova，et al.Proteins and peptides of the salivary gland secretion of medicinal leeches Hirudo verbana，H.medicinalis，and H.orientalis[J].Biochemistry（Moscow），2008，73（3）：315-320.

[59]李红霞，王文祎，徐国杰，等.采用电感耦合等离子质谱法检测水蛭药材中重金属的含量[J].北京中医药大学学报，2017，40（6）：498-502.

[60]刘君，张丽艳.宽体金钱蛭新鲜药材抗凝血有效成分分析[J].中国药物经济学，2017，12（6）：22-24.

[61]王文祎.基于電感耦合等离子质谱技术对水蛭药材重金属残留的安全评价[C].第四届中国中药商品学术大会暨中药鉴定学科教学改革与教材建设研讨会论文集.中国北京.2015-01-23.北京：中国商品学会，2015：138-141.

[62]杨谋，张选杰，张娇，等.水蛭的药用价值和养殖现状[J].当代畜牧，2018，36（18）：58-60.

[63]广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准，第四册[S].南宁：广西科学技术出版社，2005.

[64]云南省食品药品监督局.云南省中药材标准[S].昆明：云南科技出版社，2005.

[65]五代·韩保升撰.尚志钧辑.蜀本草（合刊本）[M].合肥：安徽科学技术出版社，2005.

[66]张卫，张瑞贤，李健，等.中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨[J].中国中药杂志，2013，38（6）：914-918.

[67]过立农，刘杰，杨宝，等.基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭[J].中国药事，2018，32（9）：1239-1244.

[68]关世侠，袁中文，周郁斌，等.不同品种水蛭抗凝抗血栓作用的比较[J].中国医院药学杂志，2012，32（14）：1093-1096.

[69]张金家，徐红，赵淑娟.应用直接PCR技术的药用植物批量样本快速处理及分子鉴定[J].药学学报，2017，52（11）：1763-1769.

[70]Meusnier I，Singer G A C，Landry J F，et al.A universal DNA mini-barcode for biodiversity analysis[J].BMC Genomics，2008，9（10）：1-4.

[71]赵紫霞，许建，张研，等.基于电化学生物传感技术的鱼类IHNV病毒检测方法构建[J].农业生物技术学报，2018，26（2）：357-364.

[72]赵堉文，王海霞，别松涛，等.基于DNA电化学生物传感技术的甘草提取液中大肠杆菌快检方法研究[J].中国中药杂志，2018，43（6）：1209-1214.

[73]Shi Ruixue，Hu Zhigang，Lu Hao，et al.Hierarchical Nanostructuring Array Enhances Mid-Hybridization for Accurate Herbal Identification via ITS2 DNA Barcode[J].Analytical chemistry，2020，92（2）：2136-2144.

[74]Jia J，Xu Z，Xin T，et al.Quality Control of the traditional patent medicine Yimu Wan based on SMRT sequencing and DNA barcoding[J].Front Plant Sci，2017，31（8）：926.

[75]Xin T，Xu Z，Jia J，et al.Biomonitoring for traditional herbal medicinal products using DNA metabarcoding and single molecule，real-time sequencing[J].Acta Pharm Sin B，2018，8（3）：488-497.

[76]石林春，劉金欣，魏妙洁.等.基于DNA metabarcoding技术的如意金黄散处方成分鉴定研究[J].中国科学：生命科学，2018，48（4）：490-497.

[77]Xin T，Su C，Lin Y，et al.Precise species detection of traditional Chinese patent medicine by shotgun metagenomic sequencing[J].Phytomedicine，2018，47：40-47.

[78]Du Heshan，Yang Jingjing，Chen Bin，et al.Target sequencing reveals genetic diversity，population structure，core-SNP markers，and fruit shape-associated loci in pepper varieties[J].BMC plant biology，2019，19（1）：578.

（2020-02-10收稿 责任编辑：徐颖）