抗松材线虫病马尾松体胚发生与植株再生条件优化方案探讨

余双宝

(福建省罗源县林业局,福建 罗源 350600)

1 引言

我国针叶树种产脂造林乡土树种中分布面积最广就是马尾松。但是近几年发现马尾松在生长的时候会普遍发生松材线虫病，该病的特点是发病快、容易传播，是一种非常有毁灭性的松树病害，必须从根本上抵御松材线虫病。组织培养有很多的优点：如组织培养的速度非常快、再生率非常高等，并且组织培养能够真正的实现对马尾松的大规模的繁殖。通过对抗性马尾松合子胚作为实验的材料获得再生的植株，有可能保证本身的优良抗性，还有可能比亲本抗性更强或更弱，需要一定的田间子代测试，利用测试选择优良的，淘汰一些抗性差的。随后对这些胚性细胞进行规模化生产和田间种植。现在有很多研究者也开始借鉴之前研究红松的经验来研究马尾松。如黄健秋在研究中采用3个品种的马尾松作为实验的材料，建立一系列的马尾松体胚发生的体系。但是建立的体系还存在一些问题，实验中的再生植株率只达到7.4%，且也解决不了诱导率低和再生植株的问题。所以本研究通过分析一些抗松材线虫病马尾松还没有成熟的种子，对抗性马尾松胚性愈伤组织进行诱导和优化，建立抗性马尾松悬浮培养T恤和抗性马尾松体细胞胚胎发生再生体系，在研究的时候获得了一些再生的植株，给培育抗病马尾松做出了参考[1～3]。

2 材料和方法

2.1 外植体材料的主要来源和处理方法

在进行实验的时候选择的是福州市罗源县采集出来的一些正在发育的抗性马尾松未成熟的球果，从中最终选定4株，每株选择6个球果，采集完成之后放在大概是4 ℃的冰箱里面保存7 d左右。在进行试验之前要先对种子的表面进行一定的消毒处理，之后在把它们放在75%的乙醇中，放置的时间在30 s左右，之后在放进0.1%的HgCl2里面进行灭菌处理，消毒之后还需要对种子进行一定的冲洗，最后选出来的就是抗性马尾松未成熟合子胚[4]。

2.2 生长调节剂处理抗性马尾松胚性愈伤组织诱导率测定

在做实验的时候使用的是抗性马尾松和15-1家系未成熟的种子，以LP、DCR为基本的培养基，在进行进一步的筛选，在培养基里面需要放上以下几种材料：30g/L的麦芽糖、谷氨酰胺450 mg/L,NES250 mg/L等，一共需要配置12皿，在每皿中放入3粒种子，重复进行3次左右，培养1～2个月之后观察愈伤组织的诱导率[5，6]。计算诱导率的时候可以用以下的公式算出：

胚性愈伤组织诱导率=诱导出胚性愈伤组织的外植体的个数/接种总外值体数×100%

(1)

2.3 悬浮和固体培养下胚性愈伤组织的维持与增值测定

在测定的时候主要使用的是诱导的抗性马尾松马7-6家系愈伤组织为材料，之后在增殖的时候使用液体悬浮培养和固体培养两种方法，固体培养的继代周期为15 d左右，液体悬浮培养的继代周期为7 d左右。在固体培养的时候要用LP为基本的培养基，之后在添加二氯苯氧乙酸和琼脂粉等，之后在称量刚开始的接种质量和15 d之后的愈伤组织质量。在液体培养的时候首先需要取1 g的愈伤组织作为刚开始的接种量，之后在放入液体培养中进行打散处理，培养7 d之后，在测定沉降细胞的体积。测定的方法就是把锥形瓶里面的悬浮培养细胞倒进有刻度的试管中，放置30 min之后，等细胞完全沉淀之后在读取体积的数值[5,6]。

2.4 IBA和NAA组合处理抗性马尾松体胚胚苗根系生长发育状况测定

在测定的时候使用的是诱导的抗性马尾松马7-6家系的细胞系诱导分化出来的体胚，之后在添加一些IBA和NAA，在放在设计的培养基里面观察50 d之后，看其体胚苗生长的状态和生根的情况。

2.5 油菜素内酯处理抗性马尾松体胚苗生长状况测定

在测定的时候用抗性马尾松马7-6家系诱导分化出的大概1～2 cm的体胚苗作为测定的材料，在材料里面添加油菜素，之后在放到培养基里面进行培养，在培养的时候温度需要保持在24 ℃，在40 d之后在观察体胚的生长情况。

2.6 抗性马尾松体胚苗的驯化和移栽

在驯化的时候需要选择一些比较强壮的体胚苗进行，之后在炼苗，在炼苗的时候同时还需要保证温度，适当的时候还需要撒一些水。在把驯化后的支柱进行移栽，在移栽之后需要保证育苗的温度和湿度，之后认真照顾，在种植3个月之后统计植株的成活率。在测量植株的成活率的时候可以用以下的公式：

植株的成活率=植株成活的株数/一共移栽的株数×100%

(2)

3 实验的结果和实验的分析

3.1 不同生长调节剂浓度组合对胚性愈伤组织诱导的影响

表1 不同基本培养基和激素浓度对抗性马尾松愈伤组织诱导的影响

注：外植体个数为36

通过表1分析结果发现，抗性马尾松胚性愈伤组织诱导的最佳配比就是LP+2.0 mg/L,4-D+1.0 mg/L6-BA,这个时候的诱导率能够达到27.8%。这种程度下就能保持稳定的增值状态。在进行诱导的时候还发现如果在过程的时候加入一些AgNO3还能够提高一些组织的诱导率。

3.2 悬浮和固体培养对胚性愈伤组织维持与增值的影响

通过图1分析结果能够发现，对于2种不同的培养条件下抗性马尾松胚性愈伤组织细胞结构进行观察的时候能够知道固体培养的周期比较长，在愈伤组织的时候会比较的省时间和省精力；悬浮培养的细胞活性会更高，在大量繁殖的时候悬浮培养会更合适。

A.固体培养增殖的细胞 B.悬浮培养增殖的细胞 图1 不同培养方式下抗性马尾松的细胞结构

3.3 IBA与NAA浓度组合对抗性马尾松体胚根系生长发育的影响

通过实验结果分析能够知道1.0 mg/LIBA+0.2 mg/LNAA是最佳的组合状态。

3.4 油菜素内脂对抗性马尾松体胚苗壮苗的影响

通过对实验结果的分析能够知道在没添加油菜素的时候虽然也会生长但是生长的比较缓慢，加入油菜素会有助于胚苗的生长。

3.5 抗性马尾松再生植株的移栽

在移栽的时候发现当移栽的树苗在5 cm的时候成活率能够达到90%，8cm的时候成活率能够达到82.9%，所以在移栽的时候苗高在5～7 cm是最合适的移栽时机。

4 结语

通过实验分析可知抗性马尾松胚性愈伤组织诱导的优化的过程，在对体细胞胚增值进行增值、分化和萌发、移栽等，能够培育出需要的再生植株。虽然在培养的时候还是会出现很多的问题，但现在已经能够达到大量繁殖的要求。