数字PCR 技术的发展与展望

孙华伟，张敬峰，张小飞＊

（江苏省农业科学院兽医诊断检测中心，江苏 南京 210014）

2019 年10 月24 日-27 日，第22 届中国北京国际科技产业博览会在中国国际展览中心隆重开幕，并发布首台国产全自动一体化数字PCR 仪，受到国内业界广泛关注。数字PCR 被称为“第三代”PCR技术，更擅长对复杂背景下的标本、极微量核酸标本进行检测，无疑将更好地解决非洲猪瘟的快速、科学诊断在养猪临床中的实际应用。

1 PCR 技术的发展历程

PCR 是模板DNA、引物和dNTP 在DNA 聚合酶作用下发生酶促聚合反应，特异性地合成特定核酸片段并达到富集的目的，实现体外扩增，得到所需数目的DNA，然后通过凝胶电泳或荧光定量等方式实现定性或者定量检测的方法。使用该方法，即使只有微量的样本，也能够通过大量的体外复制将病原信号加以放大，实现比较准确的诊断检测。PCR 技术的发展历程，见图1。

2 数字PCR 比传统技术在临床使用中有何优势？

2.1 数字PCR 可实现检测结果的高度重复性

图1 PCR 技术的发展历程

图2 Q- PCR 标准曲线

什么样的检测结果才算是可靠的？这个问题非常重要，尤其是在非洲猪瘟疫情肆虐的当下。任何科学的检测，可重复性都是必须要强调的，相信不少做过Q-PCR 的实验室检测人员碰到过，由于重复性差而令人崩溃的时刻。

Q-PCR 被认为是实验室检测的常规操作，但由于在Q-PCR 检测过程中影响扩增效率的因素众多，比如PCR 抑制物、酶等，不能保证其定量分析所依赖的基础—循环阈值（CT）的恒定性，使得相同实验不同次重复检测结果的重现性较差，甚至可能会得到完全相反的结果，无法满足越来越严格的定量要求。与Q-PCR 不同的是，数字PCR 不依赖于CT 值，因此不受扩增效率影响，能够将误差控制在5%以内，实现检测结果的高度重复性。

2.2 可以摆脱对标准品的依赖

在病毒的核酸载量测定方面，Q-PCR 技术的最大瓶颈在于需要依赖标准曲线。因为定量时需要的标准品既没有商品化，自己制备起来又很费时费力。数字PCR 基于单分子层面的计数可以摆脱对标准品的依赖，从而实现对病毒核酸的精准绝对定量。利用数字PCR 进行核酸的病毒载量测定，依赖其高灵敏度的特点，可以用于早期诊断和低拷贝病毒的监控，且血液和唾液是数字PCR 技术主要应用的标本类型，见图2。

3 数字PCR 在兽医检测推广中可能会遇到的问题

数字PCR 实验室检测尚无国家或行业统一标准，同时，数字PCR的灵敏度较高，因此做好实验室内部质量控制，建立规范标准的检测操作流程和结果评估分析规程是保证检测结果准确性和可靠性的前提。

4 展望

数字PCR 早已引起生物医学研究者的广泛关注，但在兽医检测领域仍处于萌芽阶段。数字PCR 的策略很简单，就是“分而治之”，这是一个很好的比喻。DNA 样品分别在独立但相同的分区中进行扩增。非洲猪瘟的横空出世，极大促进了Q-PCR 的普及[1]。但通过对江苏省多家实验室的临床调研发现Q-PCR在非洲猪瘟病毒的检测中，重复性差是一个反映较为集中的问题。就目前而言，数字PCR 仍是比较前沿的技术，但相信在不久的将来，随着数字PCR 在生物医学领域应用的逐渐成熟，数字PCR 在兽医检测领域扎根发芽是非常值得期待的，非洲猪瘟的横空出世将催化这一进程。

在非洲猪瘟的防控方面，检测结果的准与不准是两个不同的世界，隔着它们的那层窗户纸，就是检测技术的科学性。