植物抗病毒机制研究进展

代红艳，郭 巍

（沈阳农业大学 园艺学院，沈阳 110161）

植物在生长和发育过程中会受到多种病原物的侵袭，如病毒、细菌、真菌、线虫等。植物病毒是农作物的主要病原之一，病毒病害发生普遍且危害严重，且植物病毒分子变异复杂，对植物的生长发育和农业生产存在较大威胁，造成巨大的经济损失[1]。与动物病毒不同，植物病毒不能直接侵入植物表皮，需要借助昆虫、真菌等载体或植物表皮的机械伤口、气孔等进入植物细胞，其中80%的植物病毒借助昆虫、线虫等载体进行侵染[2]。病毒一旦进入宿主细胞，即脱去外壳蛋白，释放病毒基因组，并利用宿主细胞的物质和能量完成自我表达和复制，在植物体内通过胞间连丝实现胞间转运，利用维管系统的韧皮部筛管组织进行长距离运输，从而实现系统侵染[3]。

植物采用多种防御机制限制病毒的侵染，复制和运动，其中比较保守的机制有免疫受体信号传导和基因沉默（RNA沉默）[4-6]。病毒在侵染植物细胞时会向胞内释放效应因子（effector），干扰和破坏植物的基础免疫，引发植物的胞内免疫受体蛋白识别病毒的效应因子并激活效应因子触发的免疫 （effectors-triggered immunity，ETI）过程[7]。病毒的效应因子与植物的胞内免疫受体蛋白相互竞争，协同进化。近年来研究表明，植物细胞膜表面的模式识别受体 （pattern recognition receptor，PRR）也能够限制病毒感染，引起病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）触发的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）[8]。 例如，研究发现一种跨膜免疫受体NIK1（nuclear shuttle protein-interacting kinase 1，NIK1），其结构类似于参与PTI的共受体激酶BAK1（brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1），已被证明可以通过抑制宿主翻译来防御DNA病毒[9]。此外，病毒成功侵入植物细胞后，在复制的过程中会产生病毒来源的小分子RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA），vsiRNA通过反向互补配对沉默病毒基因组，消除病毒RNA，从而抑制病毒的扩散，即RNA沉默引起的防御机制。随着植物防御策略的进化，RNA沉默通常会被共同进化的病毒编码的RNA沉默抑制子/蛋白（viral suppressor of RNA silencing，VSR）（即病毒效应因子/蛋白）所抑制，从而增强对宿主的致病性。基于近来关于植物-病毒相互作用的研究报道，本文从先天免疫系统介导和RNA沉默介导两方面综述植物抗病毒机制，重点介绍植物在共同进化竞争中克服病毒侵染的机制。

1 植物先天免疫系统介导的抗病毒机制

植物的天然免疫系统具有双重识别应答的机制，即固有免疫（第1层防御系统）和效应物引起的免疫（第2层防御系统）[10]。在病原菌侵染植物的初期，病原相关分子模式 （PAMP），例如细菌鞭毛蛋白、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、真菌的葡聚糖、几丁质，会被PRR识别[11]，这个过程被称作PTI，也是植物的固有免疫，是植物的第1层防御系统。在植物与微生物协同进化过程中，病原菌进化出一些能抑制PTI信号途径，如向胞内释放效应因子来躲避或干涉植物的第1层防御系统，这便引发宿主植物产生针对性更强的由抗性基因编码抗性蛋白（R蛋白），也称胞内免疫受体来识别病原菌分泌到宿主细胞内的效应因子[12]。这种由效应物促发的免疫称作ETI，属于植物的第2层防御系统[13]。

1.1 病原相关分子模式触发的免疫

病原菌入侵植物后，植物早期的PTI应答反应十分迅速，包括激活相关离子通道、改变膜的通透性、促丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的激活、HR、活性氧 （reactive oxygen species，ROS）爆发以及一些病程相关（pathogenesis-related，PR）蛋白的产生和积累[14]，这些防卫反应限制了病原物的生长，从而起到抗病功能。PRR能够识别多种病原菌，是PTI的基础，是防御反应的第一层堡垒。富亮氨酸重复类受体蛋白激酶（leueine-rich repeat RLK，LRR-RLK）是植物中最主要的一类PRR，在调控植物体生长发育和抵抗非生物和生物胁迫过程中也扮演着重要作用[15-17]。LRR-RLK由胞外结构LRR（LxxLxLxxNxL）重复基序、跨膜结构域和胞内蛋白激酶区组成，其胞外LRR结构在病原菌信号识别过程发挥最重要的作用。自第一个LRR-RLK基因从玉米中分离出以来，许多LRR-RLK基因及其功能通过实验得到证实[18-19]。FLS2（flagellin sensitive 2）是模式植物拟南芥中发现的第一个PRR，也是目前作用机制研究得最为透彻的一个PRR。FLS2胞外具有28个LRR基序，能够识别细菌鞭毛蛋白N端保守的22个氨基酸（flg22）。FLS2与flg22的结合会诱导FLS2和BAK1（BRI1-associated receptor kinase1）形成异源二聚体，从而磷酸化下游蛋白，进而触发MEKK1-MKK4/5-MPK3/6信号级联，正调节抗病性[20-21]。BAK1是植物油菜素内酯的信号通路中BRI1的受体[22]，后归属于拟南芥植物体细胞胚胎发生类受体激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）家族成员，也被称为SERK3，胞外具有5个LRR。目前，已发现多数胞外域较长的类受体激酶如EFR、PEPR、Eix1都需要与胞外域较短的BAK1或SERK家族蛋白结合形成异源二聚体以识别不同的信号，进而调控植物的生长发育、细胞死亡和先天免疫反应[23-24]。

先前的报道认为，与真菌和细菌有所不同，病毒大多数能避开位于细胞膜上的模式识别受体PRR的识别，逃脱植物的第1层防御系统，病毒的防御主要依赖第2层防御系统的胞内R蛋白[25]。然而，近年来也有关于PTI信号传导途径上游PRR蛋白抵御病毒的研究报道。免疫共受体BAK1及BKK1（BAK1-like kinase 1）有助于拟南芥抵抗多种RNA病毒，如烟草花叶病毒 （Tobacco mosaic virus，TMV），芜菁皱缩病毒 （Turnip crinkle virus，TCV）和油菜花叶病毒（Oilseed rape mosaic virus，ORMV）[8,26]。此外，还有一种结构类似于共受体蛋白激酶的免疫受体NIK1，可抵御甘蓝曲叶病毒（cabbage leaf curl virus，CaLCuV）等DNA病毒[9]。NIK1被鉴定为双生病毒核穿梭蛋白（nuclear shuttle protein，NSP）的靶标，因此被命名为核穿梭蛋白互作激酶（NSP-interacting kinase，NIK）[27]。CALIL等[9,28]认为与配体结合后的 NIK1能够使下游组件 RPL10（ribosomal protein L10）转运到细胞核，而RPL10与LIMYB蛋白（L10-Interacting MYB domain-containing protein）互作，全面抑制编码核糖体蛋白基因的转录，从而系统性地抑制翻译，减弱病毒蛋白的产生，从而增强植物对病毒的耐受性。NIK1协同LIMYB蛋白抑制系统性翻译是一种新发现的植物抗病毒防御机制，证实了PTI信号途径也能对植物病毒起抵抗作用。

1.2 效应因子触发的免疫

FLOR在1971年提出了“基因对基因”假说，认为抗病是植物所具有的抗病基因和与之相应的病原物的无毒基因（Avr gene）结合时才得以表现的[29]。植物宿主R基因在识别病原体编码的无毒因子/效应因子的过程会引起植物的高敏应答，导致病原体侵入部位和周围细胞的快速死亡或坏死，以防止病原体在植物中传播，这种症状表现被称为超敏反应（Hypersensitive response，HR）[30]。“基因对基因”假说描述了植物的第2层防御系统ETI，而ETI的核心便是由R基因编码的胞内免疫受体R蛋白。NBS-LRR类基因是R基因的最大的一个类群，这类R基因最显著的结构特征就是含有胞内核苷酸结合序列NBS和富含亮氨酸重复LRR序列。NBS-LRR类R基因亦可根据其编码蛋白的N末端（TIR和CC）结构域的不同分为两类：TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR[29]，TIR和CC结构域在宿主识别病原效应子的过程中发挥重要作用。目前大多数已知的R蛋白均属于TIR-NBSLRR或CC-NBS-LRR[29]。

烟草N基因是第一个鉴定出的R基因，对于TMV具有一定的抗性[31]。目前，大量的植物抗病毒R基因被克隆和鉴定，例如番茄中防御番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的Sw-5基因[32]，马铃薯中防御马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）的Rx1和Rx2基因[33-34]，拟南芥中防御烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）的RTM1和RTM2基因和抵御黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的RPP8/HRT家族的RCY1基因[35-37]。胞内免疫受体Sw-5b可以识别TSWV运动蛋白的21个保守氨基酸的病毒效应基序，进而对该病毒进行防御[32]。番茄Tm-1基因的编码蛋白与病毒复制酶相互作用，扰乱病毒基因组复制，进而对TMV产生显著抗性[38]。在不断的进化过程中，病毒等病原微生物也会突变或产生新的效应因子来逃避或者抑制植物的ETI，而植物也会进化出新的R蛋白，再次激活ETI。植物与病原菌之间基因对基因的相互作用中存在着一种竞争，同时也是一种平衡，从长期的角度看，这种相互作用呈现Z字形的“拉锯战”局面[14]。

2 RNA沉默介导的植物抗病毒机制

RNA沉默（RNA silencing），是一种广泛存在于植物、真菌、动物和人等真核生物体内的保守机制，具有特异性的核苷酸序列（21～30 nt小RNA）能够导致同源mRNA降解、蛋白翻译抑制、DNA甲基化，以及异染色质形成的表观遗传学效应[39]。小RNA诱发的基因沉默发生在两种水平上，靶标mRNA的特异性降解和蛋白质翻译抑制属于转录后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）；DNA甲基化、异染色质化引起的沉默属于转录基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）。RNA沉默现象的发现是在1990年，JORGENSEN等[40]对矮牵牛导入色素合成相关的查尔酮合成酶基因，结果许多花朵的颜色变成白色或花白色。导入的基因和与其相似的内源基因同时被沉默，被称为共抑制现象（Co-suppression）。至今，30年的探索使植物RNA沉默的理论体系越来越成熟，RNA沉默技术也得到了更广泛的应用。

2.1 植物中病毒来源小RNA的生物合成

RNA沉默最显著的特征就是能产生具有序列特异性调控功能的小RNA，长度通常为21～30 nt。植物细胞中存在 miRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）、ta-siRNA（trans-acting small interfering RNA）和 natsiRNA（natural antisense siRNA）等内源的小RNA分子[41]，其中最主要的是miRNA和siRNA。miRNA是长度约21 nt的单链RNA分子，由植物内源MIR基因编码；siRNA是长度约24 nt的单链RNA分子，没有特定的编码基因，是由处于异染色质区的重复序列和转座元件等转录产生，由长的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子切割产生[42]。近年来的小RNA组的高通量深度测序结果表明，植物细胞中80%以上的小RNA是siRNA[43]，其主要作用是维持基因组的完整性。

近几年的研究表明，在病毒侵染的宿主植物中发现了大量的病毒来源的小RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）[44]。目前研究认为vsiRNA的产生是病毒复制过程中形成的dsRNA或者内部折叠形成的部分dsRNA被DCL（Dicer-like）蛋白加工形成的[45-47]。植物体内存在4种DCL蛋白，负责加工不同的dsRNA产生不同的vsiRNA，其中DCL4和DCL2分别加工产生21 nt和22 nt的vsiRNA[48]。感染正链RNA病毒的植物体内主要积累由DCL4加工产生的21 nt vsiRNA[46,49]，但是在dcl4功能缺失突变体中，主要积累由 DCL2加工的22 nt vsiRNA。野生型芜菁皱缩病毒TCV编码的沉默抑制子P38可以干扰DCL4的功能，所以在TCV感染的植物宿主中只积累依赖 DCL2的 22 nt vsiRNA[50]。而DCL3只有在 dcl2/dcl4双突变体中加工出 24 nt的vsiRNA，因而推测DCL3在对抗RNA病毒过程中作用较小[51-53]。而在DNA病毒感染的植物中DCL3是最活跃的vsiRNA加工蛋白，拟南芥dcl3突变体感染双生病毒的症状非常严重，而野生型和dcl2/dcl4双突变体感染双生病毒症状可以得到缓解，由此可见，DCL3对抵御DNA双生病毒的重要性[51]。无论在RNA病毒还是DNA病毒中，DCL1只是协助其他几个DCL蛋白，间接参与了vsiRNA的产生过程[54-55]。由于21 nt的vsiRNA主要参与RNA沉默介导的植物抗病毒防御，所以推测植物的DCL4蛋白在抗病毒过程中发挥最主要的作用[49-50,56]。

2.2 病毒诱导的转录后基因沉默

2.2.1 vsiRNA对病毒基因组的调控 在病毒感染的植物细胞中，由DCL蛋白加工而成的vsiRNA被称作初级vsiRNA。这些vsiRNA能够被含有Argonaute（AGO）的RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）招募，在ATP的参与下，siRNA解双链，通过碱基互补配对与病毒基因组RNA结合，在AGO蛋白的剪切作用下，病毒RNA降解，从而抑制病毒的扩散。被剪切的病毒基因组RNA片段利用植物宿主的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDR）蛋白扩增成新的dsRNA，继而又被DCL蛋白识别加工成新的vsiRNA，被称为次级vsiRNA。初级vsiRNA和次级vsiRNA借助植物的胞间连丝和维管系统被运输到周围细胞，或者长距离运输，沉默信号被进一步扩散，进而更加有效地限制病毒的复制和系统侵染[57-58]。

病毒基因组复制过程中能产生vsiRNA，同时vsiRNA对病毒基因组具有反馈调节作用。AGO-RISC沉默复合体对于vsiRNA对靶基因的剪切过程发挥重要的作用[56]。拟南芥中鉴定出10种AGO蛋白[59]，在番茄（Solanum lycopersicum）中鉴定出15个AGO蛋白[60-61]，在本氏烟草中鉴定出9个AGO同源物[62]。拟南芥AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO7和AGO10可以结合vsiRNA，从而参与抗病毒防御[51,63-64]。 已有研究显示，AGO1在植物抗病毒防御中可能起着最重要作用[58]，AGO2可辅助AGO1发挥功能[65]。然而，本氏烟草的AGO2在抗番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）的沉默作用中起着关键作用[66]。此外，AGO4在感染CMV的本氏烟草中体现了抗病毒功能[67]，AGO18在水稻防御水稻条纹病毒（Rice stripe tenuivirus，RSV）和水稻矮缩病毒（Rice dwarf phytoreovirus，RDV）过程中发挥重要作用[64]。有研究表明，不同AGO蛋白复合物对小RNA的招募与其5’端的首位碱基有关[68-70]。AGO1主要识别首位碱基为“U”的小RNA，如大多数miRNA；AGO2和AGO4偏好首位碱基为“A”的小RNA；AGO5主要识别首位碱基为“C”的小RNA。在抗病毒过程中，AGO蛋白在招募vsiRNA时是否遵循同样的规律则需进一步的研究。

2.2.2 病毒编码的RNA沉默抑制因子 为了抵抗RNA沉默介导的抗病毒机制，许多植物病毒进化产生了具有RNA沉默抑制活性的蛋白，使病毒得以躲避宿主的防御机制，侵染并复制，这类蛋白即病毒编码的RNA沉默抑制因子（Viral suppressor of RNA silencing，VSR）[71-74]。VSR能够提高病毒侵染寄主的成功率，决定着植物病毒致病性的强弱，所以又被称为病毒的致病因子和症状决定因子，VSR本身也为证明RNA沉默的抗病毒机制提供了强有力的证据[75]。VSR种类丰富，可以通过干扰RNA沉默的各个阶段破坏植物的防御机制，产生一种反防御，从而导致病毒RNA积累[52]。马铃薯 Y病毒（Potato virus Y，PVY)的HC-Pro（Helper component-proteinase）蛋白是第一个被鉴定的VSR，也是病毒传播和系统性运动所必要的蛋白酶的辅助组分[76]。黄显德等[77]通过构建番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）的全长侵染性克隆及其突变体，分析了HC-Pro中调控病毒致病力的保守氨基酸位点，获得了弱毒突变体，并发现弱毒突变体中病毒蛋白的积累水平确实均显著低于野生型病毒，显示HC-Pro在调控病毒致病力发挥着重要的功能。邓竹根等[75]通过转化本氏烟草鉴定了草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）的致病因子P6蛋白。VALLI等[78]的研究表明黄瓜黄脉病毒（Cucumber vein yellowing virus）的沉默抑制子P1b蛋白能够特异性结合21 nt siRNA，阻碍其行使抗病功能。基于蛋白互作实验，GONZALEZ等研究发现CMV的2b蛋白可以与AGO蛋白结合，阻止AGO蛋白对vsiRNA的切割，进而阻断病毒诱导的基因沉默过程[79]。

2.2.3 vsiRNA对宿主转录本的调控 vsiRNA指导AGO-RISC沉默复合体对病毒RNA的序列特异性剪切作用，同时也可以通过碱基互补配对靶向宿主基因，指导AGO-RISC沉默复合体对宿主基因进行特异性剪切引起PTGS。植物病毒的这种致病机制也逐步被证实，近年来的深度测序技术也证实了此类致病机制，研究中获得的大量20～24 nt的siRNA可以比对到病毒基因组序列中，且存在明显的热点区域[80]。花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）的35S的前导序列是产生vsiRNA热点区域，其中一段20 nt的序列与拟南芥Atlg76590基因的5’UTR区域几乎完全互补配对，在受CaMV侵染的拟南芥中，Atlg76590基因表达水平显著下调，表明了CaMV的vsiRNA对拟南芥基因的调控作用[55]。CMV的侵染可引起宿主的黄化症状，测序发现该病毒的卫星RNA来源的vsiRNA特异靶向了1个叶绿素生物合成的相关基因（CHLI）的22 nt序列，导致CHLI基因的显著下调，破坏了叶绿素生物合成途径，从而引起黄化症状[81]。早期研究认为病毒侵染植物引发的病症主要是VSR对宿主发育功能相关的重要的内源siRNA的调控作用[82-84]，近年来研究发现vsiRNA可以通过碱基互补配对靶向宿主基因，引起宿主基因的沉默，影响宿主发育，形成各类病毒感染症状。与此同时，不同的VSR也可能抑制vsiRNA对潜在宿主靶标的调控。此外，vsiRNA对于宿主基因表达的调控程度也可能取决于vsiRNA的丰度[85]。

2.3 病毒诱导的转录基因沉默

近来也有研究指出，siRNA介导的甲基化所引起的TGS也是抵抗DNA病毒的一种防御方式[86]。由DCL3参与加工而形成的24 nt siRNA是一些甲基化转移酶（Methyltransferase）活化的起始信号。siRNA与AGO4、AGO6或AGO9结合，介导甲基化转移酶使DNA区域包含胞嘧啶-鸟嘌呤核苷酸连续区（称为CG岛）、CNG（N：A/T/G/C）和CHH（H：A/T/C）中的胞嘧啶核苷C与组蛋白H3亚基的第9个赖氨酸K（lysine residue K9 in histone H3，H3K9）发生甲基化，基因表达因此而受到抑制，即siRNA在转录水平调控了基因的表达[87-88]。植物利用siRNA指导的DNA甲基化作为对双生病毒的表观遗传的防御，拟南芥甲基化缺陷型突变体对双生病毒更易感[89-90]。一些DNA病毒可通过干扰对甲基循环中的关键蛋白DCL3、AGO4等来抑制TGS过程[53]。双生病毒成员中国番茄黄化曲叶病毒（T omato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的β卫星编码的蛋白βC1致病因子通过抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH）的活性靶向甲基化循环，来稳定双生病毒/β卫星RNA复合体，最终诱发病症[91]。双生病毒还可以通过降低甲基转移酶1（Methyltransferase 1，MET1）和植物甲基化周期的关键酶染色体甲基化酶3（Chromomethylase 3，CMT3）的转录水平，来干扰病毒感染宿主的DNA甲基化机制[92]。

3 展望

植物的先天免疫系统和RNA沉默介导的抗病毒机制是目前研究比较清楚的两条抗病毒途径，能够抑制病毒的增殖和系统侵染。同时，病毒也通过不断变异和编码VSR对植物进行反防御。病毒的VSR既能够作为效应因子破坏植物的第1层免疫系统，又能够作为沉默抑制子干扰RNA沉默，是病毒致病性强弱的重要决定因子。近年来植物的抗病毒防御研究取得了重大进展，但是关于病毒的致病性策略和植物防御之间的动态关系等关键问题，仍尚不明晰。例如，并不清楚能够引起植物PTI防御的病毒PAMP是什么，能够识别病毒的PRR尚未被确定。植物的R基因与病毒的效应因子互作后，如何引起系统性抗性需要进一步研究。当前，有关vsiRNA在翻译水平上起抑制作用的抗病研究报道还非常少。此外，病毒-植物相互作用可以调节植物激素通路，引起激素介导的防御反应，如水杨酸信号、茉莉酸信号和油菜素内酯信号。植物还可以通过泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）作为抗病毒防御策略[28,93]。不同的防御途径之间相互交叉，协同作用。第1层免疫系统的关键蛋白LRR-RLK能够参与水杨酸信号、油菜素内酯信号和脱落酸等植物激素信号途径[94]。番茄斑点枯萎病毒的vsiRNA能够靶向多种编码抗性相关蛋白的基因，如CC-NBS-LRR蛋白、AP2乙烯应答转录因子和热激转录因子A3[95]。然而，未来植物抗病毒相关研究不但在于对已知防御策略的深入研究，还在于整合不同的植物防御策略（RNA沉默、先天免疫和激素信号），这些防御策略的协同作用有望确保对病毒产生更加强大而持久的防御反应。