高效液相色谱法测定微球中硫酸小檗碱的含量

朱庆贺，王丽坤，张艳，杨旭东，王爽，陈曦，王观悦，穆永才，罗天瑶，史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔161005)

硫酸小檗碱(Berberine Sulfate)是由含有小檗碱的植物中提取的一种生物碱，在黄连、黄柏、三颗针等植物中含量丰富。硫酸小檗碱具有清热解毒、抗感染等功效[1]，与甲氧苄胺及抗菌肽等合用对大肠杆菌等细菌有协同作用[2-4]，有研究表明硫酸小檗碱对猪轮状病毒有一定抑制作用[5]，兽医临床中常用于动物细菌性肠炎、各种化脓性感染的治疗。载药体系微球制剂具有高效无毒、释药速率恒定以及粒径可控的优点[6]，黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院兽药研究室结合硫酸小檗碱及微球特性制备了硫酸小檗碱微球制剂，为进一步进行硫酸小檗碱含量检测需要，建立了微球中硫酸小檗碱含量的高效液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 硫酸小檗碱标准品(含量98.0%，中国食品药品检定研究院)；硫酸小檗碱微球制剂(规格：2%，自制)；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；无水乙醇(分析纯，天津市百世化工有限公司)。

1.1.2 仪器 电子分析天平，MS104TS/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司；高效液相色谱仪，LC-20AT SPD-20A，SHIMADZU；纯水仪，XYE2-20-H型，北京湘顺源科技有限公司；实验室pH计，FE20型，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；注温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长349 nm；检测器：SPD-20A；进样量5 μL；流动相：乙腈：水(45∶55)。

1.2.2 溶液制备

1.2.2.1 对照品溶液 精密称取经105 ℃干燥至恒重的硫酸小檗碱对照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成98 μg/mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液5 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为对照品溶液。

1.2.2.2 供试品溶液 按照配方比例制备硫酸小檗碱微球制剂，精密取样品适量(相当于硫酸小檗碱10 mg)，置100 mL容量瓶中，加流动相充分溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取此液1 mL置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。

1.2.2.3 阴性对照品溶液 按配方比例量取与供试品溶液相当的基质溶液(与硫酸小檗碱微球制剂相比只是不含硫酸小檗碱，其他成分相同)适量，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

1.2.3 系统专属性考察 分别取硫酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按1.2.1项色谱条件进样测定。

1.2.4 方法检测限与定量限 取供试品溶液加流动相稀释，分别配制成0.001，0.002，0.004，0.008和0.016 μg/mL浓度的检测样品溶液，按1.2.1项下色谱条件进样测定。测得基线噪音值，按信噪比S/N≥3确定方法的检测限(LOD)，按按信噪比S/N≥10确定方法的定量限(LOQ)。

1.2.5 线性试验 精密量取对照品储备液适量，分别置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，配置成浓度分别为0.098、0.98、4.90、24.50、49.00 μg/mL的系列对照品溶液。按1.2.1项色谱条件进样测定，以峰面积(y)对硫酸小檗碱的浓度(x，μg/mL)进行线性回归方程。

1.2.6 回收率测定 取1.2.2项下制备的储备液，分别精密量取适量并添加配方剂量的空白基质，用流动相稀释成低(L=0.98 μg/mL)、中(M=24.50 μg/mL)、高(H=49.00 μg/mL)3 种理论浓度的对照品，每个浓度配制 3 份，按1.2.1项色谱条件进样测定，并利用外标法计算其含量。

1.2.7 精密度试验 取1.2.2项制备的储备液适量，用流动相稀释成24.50 μg/mL的标准溶液，按1.2.1项色谱条件重复进样6次，分别测定其峰面积。

1.2.8 稳定性试验 取1.2.2项制备的储备液适量，用流动相稀释成24.50 μg/mL的标准溶液，按1.2.1项色谱条件分别于0、2、4、8、10、12 h测定其峰面积。

1.2.9 样品含量测定 精密量取批号为20151101、20160125、20170607的3批次的硫酸小檗碱微球样品适量，每批次3份，按1.2.2项制成供试品溶液，分别进行含量测定。

2 结果与分析

2.1 系统专属性考察 分别取硫酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按1.2.1项色谱条件测定，结果见图1。在该色谱条件下，硫酸小檗碱的保留时间k为26.9 min左右，阴性对照在此时间附近没有出峰，因此，对硫酸小檗碱HPLC的测定没有影响，专属性能满足检测要求。

2.2 方法检测限、定量限的确定 按信噪比S/N≥3确定检测限(LOD)，按信噪比S/N≥10确定其定量限(LOQ)。经测定，本方法对硫酸小檗碱微球制剂中硫酸小檗碱的LOD为0.001 μg/mL，LOQ为0.002 μg/mL。

2.3 线性试验 配制0.098、0.98、4.90、24.50、49.00 μg/mL的系列对照品溶液，分别按1.2.1项色谱条件进样测定，以峰面积(y)对硫酸小檗碱的浓度(x，μg/mL)进行线性回归方程，得回归方程为y=64832x+47399，R2=0.9991。结果表明硫酸小檗碱在0.098～49.00 μg/mL范围内线性关系良好(图2)。

图2 硫酸小檗碱标准曲线

2.4 回收率测定 分别测定低(L=0.98 μg/mL)、中(M=24.50 μg/mL)、高(H=49.00 μg/mL)3 种理论浓度的对照品溶液的峰面积,并计算其实测浓度，结果表明高、中、低浓度对照品溶液中硫酸小檗碱的平均回收率为98.98%，该方法回收率符合要求(表1)。

表1 硫酸小檗碱的回收率

回收率R% = 实测浓度/理论浓度 × 100%

2.5 精密度试验 制备得24.50 μg/mL的标准溶液，按1.2.1项色谱条件重复进样6次，测定其峰面积分别为1849872、1796579、1846351、1860479、1851674、1847562。计算RSD为1.24%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 制备得24.50 μg/mL的标准溶液，按1.2.1项色谱条件分别于0、2、4、8、10、12 h测定其峰面积分别为1849852、1896754、1846851、1861456、1844598、1857562，平均峰面积为1859512，RSD为1.04%，表明样品在12 h内含量稳定。

2.7 样品含量测定 批号为20151101、20160125、20170607的3批样品中硫酸小檗碱平均含量分别为标示量的98.18%、101.41%、103.29%，符合规定。

3 讨论与结论

3.1 色谱条件 应用二级阵列检测器对对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行扫描得知，硫酸小檗碱标准品溶液在229、349 nm处有最大吸收峰，另外，参考文献报道[7-9]得知，小檗碱在349 nm为常用紫外测定波长。因此,选择349 nm波长下测定硫酸小檗碱微球制剂中硫酸小檗碱的含量。通过色谱结果的比较分析，在349 nm波长下测定，能够获得最大的灵敏度和抗干扰能力，本试验中选择349 nm作为硫酸小檗碱含量的检测波长。试验中比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-磷酸二氢钾溶液作为流动相的分离效果，结果表明，乙腈-水在经过比例调试(45∶55)后分离效果最好，分离得到的硫酸小檗碱峰型良好，无拖尾现象，分离度大，因此,选择乙腈-水(45∶55)为检测流动相。

3.2 小檗碱的含量检测方法 小檗碱的主要成盐形式包括盐酸盐和硫酸盐，盐酸小檗碱作为临床中常用中药成分，研究较多。而硫酸小檗碱在兽医临床领域，尤其是制剂含量检测方面文献较少。因此，建立硫酸小檗碱的含量检测方法对于硫酸小檗碱的药物规范化应用具有重要意义。李华芩[10]等首先利用分光光度计法建立了注射液中硫酸小檗碱含量检测方法，该方法适用于企业进行产品的质量控制。之后又利用HPLC建立了注射液中硫酸小檗碱的含量检测方法，但由于未购得硫酸小檗碱标准品，所以用盐酸小檗碱标准品进行代替[7]。本研究因剂型优化，制备了硫酸小檗碱微球制剂，但尚无微球制剂中硫酸小檗碱的含量检测方法，因此,本试验利用HPLC建立了微球中硫酸小檗碱的含量检测方法，为以后硫酸小檗碱微球制剂的含量检测提供技术支持。

本实验室成功研制了硫酸小檗碱微球制剂，兼具了硫酸小檗碱和微球制剂的共同优点，是兽医临床中一种良好的长效缓释剂型[6]。为了这一新剂型的更好应用，建立了硫酸小檗碱的HPLC检测方法，本方法分离度好，硫酸小檗碱的保留时间在26.9 min左右，峰形好，基本无拖尾，杂质不干扰实验测定，而且采用外标法测定硫酸小檗碱微球的含量操作简单，结果准确，回收率高，重现性好，可以为微球中硫酸小檗碱含量的检测提供参考。