20个小粒种咖啡种质氮吸收效率差异分析

董云萍 闫林 黄丽芳 林兴军 孙燕 王晓阳 龙宇宙

摘  要：为明确不同基因型小粒种咖啡的氮素吸收特性，进一步为遗传改良咖啡氮营养性状提供参考，本研究对同一氮素供应水平下20个小粒种咖啡氮素吸收效率的生理、形态机制进行研究。结果表明：大部分小粒种咖啡种质间叶绿素含量、硝酸还原酶活性（NRA）、根氮、茎氮、叶氮含量差异不显著，且叶绿素含量及NRA与叶氮、总氮累积量和氮吸收效率间相关性不显著;根长、根体积、根表面积均与根氮累积量、总氮累积量、氮吸收效率呈显著正相关;氮素在植株各器官的分配比例依次为：根氮>叶氮>茎氮;聚类分析表明，‘M13氮吸收效率最高，为84.43%，最低为‘CATUAI，仅为32.12%，其余种质为58.36%～43.08%。

关键词：小粒种咖啡;氮素;吸收效率中图分类号：S571.2      文献标识码：A

Analysis of Nitrogen Uptake of 20 Coffea arabica L. Accesions

DONG Yunping1，2， YAN Lin1，2，3， HUANG Lifang1，2，3， LIN Xingjun1，2， SUN Yan1，2， WANG Xiaoyang1，2，3， LONG Yuzhou1，2*

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 3. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： A pot experiment with the same nitrogen level was carried out to analyze the root morphological and physiological properties which affecting the nitrogen uptake efficiency of 20 arabica coffee genotypes to understand the characteristic of nitrogen uptake and to provide a material basis for the selective breeding. There were no significant difference in chlorophyll content， nitrate reductase activity （NRA）， nitrogen content in root （NCR）， nitrogen content in stem （NCS）， nitrogen content in leaf （NCL） among most genotypes. There existed rather weak correlation among chlorophyll content， NRA， N accumulation in leaf （NAL）， N accumulation in total （NAT） and N uptake rate （NUR）. Root length， root volume and root surface area were positively correlated with root nitrogen accumulation， NAT and NUR. The nitrogen distribution order was NCR>NCL>NCS. Cluster analysis demonstrated that the highest NUR was ‘M13 （84.43%）， the lowest was ‘CATUAI （32.12%）， and the rest was 58.36%-43.08%.

Keywords： Coffea arabica L.; nitrogen; uptake rate

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.001

氮是作物不可缺少的營养元素之一，作物各个器官的形成和发育均需要大量的氮素。咖啡结果量大，对氮、磷、钾的需要量较大。蔡志全等[1]研究表明，氮缺乏对小粒种咖啡生长、光合特性和产量的影响最大，其次为钾，而磷的影响相对较小。据国外资料显示，年产1 kg咖啡干豆需纯氮0.1 kg。印度中央咖啡研究所从大量的肥料试验推断，每年咖啡氮素的需要量是90～160 kg/hm2。Sala manca-Jimenez等[2]开展施肥对营养期咖啡氮利用效率的影响研究，虽然施氮在4个月后提供了约20%～29%的植株氮，但来自于肥料氮的利用率仅5%。氮肥的施用对咖啡产量和品质的提高均起到了巨大的作用，有力地推动了产业的发展，但同时N肥的过量施用使得其利用率明显下降，造成了化肥资源和经济的损失，也导致水体和大气的污染以及产品品质的下降。

作物无论在不同种属之间还是同一种作物的不同品种之间均存在氮效率的差异。其差异主要表现在吸收硝态氮和铵态氮的能力、硝酸还原酶水平、体内无机氮储存库大小、氮素在体内的再利用等方面[3]。根据作物基因型的差异选育氮高效品种，减少氮肥用量，提高氮肥的利用效率已在玉米[4]、小麦[5]、水稻[6]、油菜[7]等作物上进行了深入的研究。

国外学者利用15N标记的方法对咖啡植株各部分对氮的吸收利用进行研究，从而评估氮肥农学利用效率，但由于其方法取样手段、检测水平的限制，研究结果存在较大误差[8]。而对咖啡种质资源进行氮效率筛选研究未见报道。本研究通过盆栽试验对咖啡种质做了筛选，以期发现咖啡氮利用高效和低效种质，探究不同种质氮效率差异的农学机制和生理学机制，为发掘优良的咖啡种质资源，进一步为遗传改良咖啡氮营养性状提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料

2013年1月从农业农村部瑞丽咖啡种质资源圃和中国热带农业科学院香料饮料研究所咖啡种质圃采集20个小粒种咖啡种质成熟鲜果，种质名称及来源见表1。

1.2  方法

1.2.1  试验设计  各种质咖啡鲜果经脱皮、脱胶、凉干后沙床催芽，待子叶平展时移植到直径10 cm、高12 cm营养袋培育，5对真叶时转入直径25 cm、高30 cm塑料花盆培育，培育基质为中细河沙，每个种质20盆。按改良霍格兰方法配制营养液，浓度为：Ca（NO3）2·4H2O 4.0 mmol/L、KNO3 5.0 mmol/L、NH4NO3 1.0 mmol/L、KH2PO4 1.0 mmol/L、MgCl2·6H2O 2.5 mmol/L、FeSO4·7H2O 20.0 μmol/L。6月龄前每次每株施1/3浓度配制营养液300 mL，共施3次;6～15月龄每次每株施配制营养液500 mL，1.5个月施1次，共施6次。

1.2.2  测定方法  （1）叶绿素含量测定苗龄。15个月时，选择每个种质生长一致的苗木5株挂牌，每1植株选取从顶芽往下数第3对成熟叶片，采摘其中1片带回实验室用纯水冲洗叶片，吸水纸擦干叶片水分后，用剪刀剪取不带主脉的叶片0.2000 g（精确到0.0001 g），新鲜叶片切碎后放入25 mL容量瓶中，在容量瓶中加入纯丙酮∶无水乙醇∶蒸馏水（4.5∶4.5∶1.0）的混合液15 mL，并仔细将黏附在瓶壁上的叶片洗到混合提取液中，定容到刻度后，在25～30 ℃恒温箱中浸提过夜，期间摇动1～2次，次日取出，观察叶片组织如果完全变白，则表示叶绿素已经浸提干净，然后在波长为645 nm和663 nm下用分光光度计分别比色测定其光密度值。

（2）硝酸还原酶活性测定。用活体法，选择挂牌的每个种质植株选取从顶芽往下数第3对成熟叶片，带回实验室用纯水冲洗叶片，吸水纸擦干叶片水分后，称0.3 g叶样，将叶片剪成0.2～0.3 cm小方块，放入装有混合液（4 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液+5 mL 0.2 mol/L硝酸钾溶液）的注射器中，对照先加1 mL 30%三氯乙酸，再加混合液，在黑暗条件下反复抽气直到放气后叶片变软并沉入液体，30 ℃暗条件下保温30 min，取出后立即加入1 mL 30%三氯乙酸终止酶反应。吸取上清液1 mL于另一试管中，加入2 mL 1%对氨基苯磺酸和2 mL 0.2% α-萘胺，室温显色30 min后测定520 nm波长下的光密度值。

（3）根系形态及生物量的测定。苗龄15个月时从每个种质中选生长一致的苗木3株，脱盆后，将根部的泥沙用自来水冲洗干净，带回实验室，每株分成叶片、茎干、根共3部分，用吸水纸吸干根部水分后，分别称量各部分鲜重。将根系分成侧根和主根2部分，放置于有水的根盒中，让侧根舒展不重叠，用根系扫描仪扫描，Win RHIZO 2013分析主根长、侧根长、主根直径、侧根直径、根体积、根表面积，测定完成后将全株各部分放置于烘箱，105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒重，分别称其干重。

（4）氮素含量的测定。取烘干的每个种质叶片、茎干、根各3 g，用植物样品粉碎机磨碎，杜马斯定氮仪NDA701测定。

1.2.3  计算方法  叶绿素a含量（mg/g）=[（12.7? OD663?2.59?OD645）?V]/（FW×1000）

叶绿素b含量（mg/g）=[（22.9?OD645?4.67? OD663）?V]/（FW?1000）

总叶绿素含量=叶绿素a含量+叶绿素b含量

式中：OD663表示样液在波长663 nm下的光密度值，OD645表示样液在波长645 nm下的光密度值，V为定容体积，FW为称取的叶样鲜重。

氮素累积量 = 植株各部分干重 × 各部分氮素含量

氮素吸收效率 = 植株总氮累积量/生长期供氮量?100%

1.3  数据处理

采用 Excel 2010软件整理数据，采用SPSS 19.0软件中的ANOVA进行方法分析，采用LSD法进行多重比较，采用系统聚类法进行聚类分析，采用Pearson相关法进行相关性分析。

2  结果与分析

2.1  不同小粒种咖啡种质叶绿素含量、硝酸还原酶活性及氮含量差异分析

由表2可见，‘CATURRA和‘CA ZHONG I叶绿素含量显著高于‘M14、‘RUME SUDAN、‘CAT IMOR P1等12个种质;‘M2、‘铁毕卡、‘DTARI 028等7个种质叶绿素含量较低，为3.56～3.09 mg/g，显著低于绿素含量为4.70～ 4.21 mg/g的‘CATURRA和‘CA ZHONG I、‘CATUAI等8个种质，其余种质间叶绿素含量差异不显著，叶绿素含量最低的‘德热296叶片为紫色。

‘T8867、‘M10叶片硝酸还原酶活性显著高于‘CATURRA、‘铁比卡、‘波帮等14个种质，‘热引2、‘CA ZHONG Ⅲ、‘DTARI 028等5个种质叶片硝酸还原酶活性较低，为14.61～9.34 mg/（g·h），显著低于硝酸还原酶活性为32.81～21.36 mg/（g·h）的‘T8867、‘M10、‘CIFC 7963等10个种质，其余种质间差异不显著。

通过分析可知，咖啡种质叶绿素含量高，其叶片硝酸还原酶活性也高，但‘RUME SUDAN、‘CA ZHONG III、‘M10、‘巴矮、‘波帮、‘德热296、‘热引2和‘铁毕卡例外。

‘CA ZHONG II根氮含量显著高于其余种质，‘M14根氮含量最低，与‘巴矮差异不显著，与其余种质差异显著。‘CA ZHONG IIII茎氮含量显著高与其余种质，但其余种质间差异不显著。‘CA ZHONG II叶氮含量显著高于‘M13，且这2个种质叶氮含量显著高于其余种质，其余种质间叶氮含量差异不显著。可见，测定的大部分小粒种咖啡种质间根氮、茎氮、叶氮含量差异不大。从氮在植株各器官的分配来看，根氮含量较高，其次为叶氮，最低为茎氮。

2.2  不同小粒种咖啡种质根系生长参数分析

由表3可见，‘M13侧根长显著高于‘CATI M- OR P1、‘CATURRA、‘CATUAI等8个种质，与‘T8867、‘S288、‘热引2等11个种质间差异不显著。‘M13根体积除显著于‘CATUAI外，与其余种质间差异不显著。

‘M13根表面积显著大于‘波邦、‘RUME SUDAN、‘CATUAI等4个种质，与其余种质间差异不显著。多重比较结果表明，大部分小粒种咖啡种质间侧根长、根体积、根表面积差异不显著。

2.3  不同小粒种咖啡种质氮累积量和氮吸收效率差异分析

由表4可见，‘M13根氮累积量最高，‘M13与‘CATIMOR P1、‘CIFC 7963、‘CA ZHONG I等8个种质差异不显著，而且‘CATIMOR P1、‘CIFC 7963、‘巴矮等14个种质间差异不显著;茎氮累积量最高为‘M13，‘M13与‘M14、‘RUME SUDAN、‘M2等5个种质差异不显著，‘RUME SUDAN与‘铁毕卡、‘CA ZHONG I、‘M10等11个种质间差异不显著;‘M13叶氮累积量显著高于‘CA ZHONG II，且这2个种质叶氮累积量显著高于其余种质，剩余大部分种质间差异不显著。综合表2、表3、表4可知，在大部分小粒种咖啡种质间根氮、茎氮、叶氮含量差异不大的情况下，各种质氮累积量大小主要取决于植株各部分干物质累积量，虽然‘CA ZHONG II根氮、茎氮含量较高，但由于其根和茎干物质累积量小，因而其相应部位氮累积量小。‘M13总氮累积量、氮吸收效率显著高于其余种质，其余大部分种质间差异不显著。

对20个小粒种咖啡种质氮吸收效率进行聚类分析，分为3类（图1）。氮吸收效率最高的种质为‘M13，氮吸收效率达84.43%，最低为‘CA T UAI，仅为32.12%，其余种质氮吸收效率为58.36%～ 43.08%。

2.4  不同小粒种咖啡种质各参数间的相关性分析

不同小粒种咖啡种质各参数间相关性分析结果见表5，叶片硝酸还原酶活性与叶氮累积量、总氮累积量、氮吸收效率间相关性不显著;同样，叶绿素含量与叶氮累积量、总氮累积量、氮吸收效率相关性不显著;根长、根体积、根表面积均与根氮累积量、总氮累积量、氮吸收效率呈显著正相关。

3  讨论

植物吸收的主要无机氮形式是铵（NH4+）和硝酸盐（NO3-），硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶。研究表明，作物品种的氮素同化能力与各生育期硝酸还原酶活性表现为不同程度的正相关[9]。朱德群等[10]、郑元明[11]研究表明，小麦苗期氮积累总量和硝酸还原酶活性呈显著正相关。在施氮条件下，油菜氮高效品种功能叶的叶绿素含量和硝酸还原酶活性较强[12]。张旭等[13]研究表明，小麦氮高效型品种开花期其叶的叶绿素和氮含量、净光合速率、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性较高。然而Eicheloerger等[14]报道，以NRA为指标对玉米进行选择到8代时，高NRA品系的NRA己达到低NRA的4倍，然而两者的产量都比原亲本低，故NRA在实际育种中的价值难以确定。本研究在施氮量相同的情況下，对20个小粒种咖啡种质叶片硝酸还原酶活性分析表明，大部分咖啡种质间NRA差异不显著，且NRA与叶氮累积量、总氮累积量和氮吸收效率间相关性不显著。NRA是否可作为筛选咖啡氮高效品种的指标有待进一步的研究。莫良玉等[15]研究表明，由谷氨酰胺合成酶（Gs）和谷氨酸合成酶（GOGAT）催化的氨（NH4+）同化为有机含氮化合物的同化途径，即Gs-GOGAT途径才是植物氨同化更为普遍和重要的方式。GS被认为与作物的氮效率[16]和耐低氮性[17]有关。Tiago等[18]研究表明，在缺氮的条件下，NH4+是小粒种咖啡根首选的无机氮源。因此，有必要进一步开展不同咖啡种质Gs活性及其与咖啡氮素效率的相关性研究。

氮素是叶绿素的主要成分，施氮一般能促进植物叶片叶绿素的合成，增强光合作用。叶片含氮量与叶绿素含量有着较强的指数函数关系，在一定条件下，可根据作物叶绿素含量确定叶片含氮量[19]。刘代平等[20]研究认为，在施氮条件下油菜功能叶叶绿素含量与氮效率密切相关，但在不施氮条件下，油菜功能叶叶绿素含量对氮效率影响较小。本研究结果，叶绿素含量与叶片氮含量间没有对应关系，叶绿素含量较高的种质如‘CA T U RRA、‘CA ZHONG I、‘CATUAI、‘T8867，其叶片氮含量并不高，叶绿素含量与叶氮累积量、总氮累积量、氮吸收效率相关性不显著。这可能与大部分小粒种咖啡品种间叶绿素含量差异不大有关，另一方面，小粒种咖啡品种叶绿素含量受光照强度、水分等因素的影响更大。

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