血清miR127-3P与原发性肝癌的相关性研究

沈张平 王钦君 季沈杰

微小RNA(microRNA，miRNA)属于非编码RNA，对靶基因的转录和蛋白翻译的过程中发挥显著作用[1]。既往研究报道显示[2-3]，miRNA参与了多种肿瘤细胞的分化、局部浸润、转移及凋亡，因此，miRNA也有可能作为肿瘤的血清标志物之一。miR127-3P作为一种小分子的非编码RNA，在乳腺癌患者血浆和组织中的表达显著升高，并可作为乳腺癌的一个筛查指标[4]，miR127-3P不仅与乳腺癌有关，也参与了胶质母细胞瘤[5]、卵巢癌[6]等发病机制，但目前关于肝癌与miR127-3P的相关性研究较少。本研究通过RT-PCR法探讨肝癌患者血清miR127-3P的相对表达量及评估其在诊断肝癌中的临床效能。

资料与方法

一、一般资料

回顾性收集2016年1月1日—2018年6月1日于我院就诊的95例原发性肝癌患者、35例乙肝肝硬化患者、30例慢性乙型肝炎患者及30例健康体检者血清。原发性肝癌及慢性乙型肝炎诊断标准符合“原发性肝癌诊疗规范(2017年版)及病毒性肝炎防治方案”[7-8]；乙肝肝硬化诊断依据为“既往乙型肝炎病史多年，现肝脏肝硬化通过B超或CT确诊”。原发性肝癌患者男51例，女44例，平均年龄(54.63±11.25)岁；乙肝肝硬化组患者男16，女19，平均年龄(51.28±9.55)岁；慢性乙型肝炎患者男14例，女16例，平均年龄为(49.25±12.11)岁；对照组男女各15例，平均年龄(55.64±10.66)岁。上述研究对象均知情同意且签署知情同意协议书，本研究经过我院伦理委员会批准。

二、研究方法

(一)血清标本收集 清晨空腹抽取95例肝癌患者、35例肝硬化患者、30例慢性肝炎患者和30例健康体检者外周静脉血3 mL于试管中，静置20 min后于转速为8 000 r/min的4℃离心机中离心10 min，为去除残余细胞成分，取上层血清转移至另一试管中，再次于转速为13 000 r/min的4℃离心机中离心10 min，最后取500 μL血清转移至无RNA酶的EP管中分装，放入-80℃冰箱保存。

(二)总RNA提取及浓度测定 取出样本后快速置于37℃水浴锅中解冻，每管加入700 μL Trizol后震荡并静置3 min，再加入0.2 mL氯仿震荡并静置3 min，离心后取上层水相于新的无RNA酶的EP管中，再次加入等体积异丙醇混合静置并离心除去上清液，使用1 mL 75% DEPC酒精洗涤沉淀并室温干燥，最后加入25 μL DEPC处理的ddH2O水溶解RNA。总RNA浓度采用紫外分光光度计测定其吸光度(A260/A280)，当A260/A280值为1.8～2.2后继续下一步实验。

(三)逆转录和实时荧光定量-PCR 按照逆转录试剂盒进行逆转录反应(miScript II RT逆转录试剂盒，德国QIAGEN公司)，反应体系为：miScriptHispct(5x)4 μL，miScriptNucleics(10x)2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA模板12μL。逆转录条件：37℃ 60 min，95℃ 10 min。最后加入80μL ddH2O水稀释。按照试剂盒进行qPCR反应(miScript SYBR Green试剂盒，德国QIAGEN公司)，反应体系10μL：预加热95℃，30 min，变性94℃，15 s，退火55℃，30 s，延伸70℃，30 s，一共40个循环。Ct值为反应孔的荧光信号达到设定阈值的循环数。采用U6作为内参，血清中miR127-3P的相对表达量为2-△Ct=CtmiR-127-3P-CtU6。

三、统计学方法

采用SPSS17.0 统计学软件进行数据处理，所有指标不符合正态分布，以中位数和四分位数表示，两样本比较采用Mann-Whitney检验；Pearson相关分析原发性肝癌患者血清miR127-3P相对表达量与AFP的相关性，并采用logistic回归分析原发性肝癌患者miR127-3P相对表达量的影响因素。利用ROC曲线分析miR127-3P相对表达量鉴别原发性肝癌与乙肝肝硬化、慢性乙型肝炎及健康对照组的临床效能，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、 原发性肝癌组、乙肝肝硬化组、慢性乙型肝炎组及健康对照组血清miR127-3P的表达

原发性肝癌组、乙肝肝硬化组、乙型肝炎组及对照组血清miR127-3P相对表达量中位数及四分位数分别为0.60(0.50～0.63)，0.46(0.41～0.51)、0.29(0.2～0.46)、0.25(0.21～0.31)，任何两组间比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)，其中原发性肝癌组血清miR127-3P相对表达量显著高于乙肝肝硬化组、慢性乙型肝炎组及对照组，差异均具有统计学意义(统计量分别为-5.768、-6.120、-7.369，P均<0.05)。

二、 原发性肝癌组血清AFP与miR127-3P相对表达量的相关性

95例原发性肝癌患者血清AFP为83.28±22.63 ng/mL，Pearson相关分析结果显示，原发性肝癌患者血清AFP与miR127-3P相对表达量呈显著正相关性(r=0.868，P=0.000)。结果见图1。

图1 原发性肝癌组血清AFP与miR127-3P相对表达量的相关性分析

三、 血清miR127-3P的相对表达量在不同临床特征原发性肝癌患者中的差异

单因素分析结果显示，血清miR127-3P的相对表达量在病程时间、肿瘤细胞分化程度、有无远处转移、TNM分期及病灶数目等存在显著差异(均P<0.05)，原发性肝癌患者病程时间越长、肿瘤细胞分化程度越低、存在远处转移、TNM分期越高及病灶数目多发，血清miR127-3P的相对表达量越高。具体结果见表1。

表1 不同临床特征原发性肝癌患者血清miR127-3P的相对表达量的比较

四、 原发性肝癌患者血清miR127-3P的相对表达量的影响因素

logistic分析结果显示，肿瘤细胞分化程度越低(OR=3.236)、TNM分期越高(OR=4.369)、存在远处转移(OR=5.687)均是原发性肝癌患者血清miR127-3P的相对表达量升高的危险因素，具体结果见表2。

表2 原发性肝癌患者血清miR127-3P相对表达量的影响因素

五、 原发性肝癌组血清miR127-3P的相对表达量鉴别乙肝肝硬化、慢性乙型肝炎及健康对照组的临床效能

ROC曲线结果显示，miR127-3P的相对表达量鉴别原发性肝癌与乙肝肝硬化的曲线下面积为0.829(95%CI：0.755～0.903)，当截断值为0.535时，此时敏感度和特异度分别为68.4%和94.3%；miR127-3P的相对表达量鉴别原发性肝癌与慢性乙型肝炎的曲线下面积为0.870(95%CI：0.783～0.957)，当截断值为0.445，此时敏感度和特异度分别为91.6%和73.3%；miR127-3P的相对表达量鉴别原发性肝癌与健康对照的曲线下面积为0.945(95%CI：0.891～0.999)，当截断值为0.410，此时敏感度和特异度分别为91.6%和90%。结果见图2～4。

图2 miR127-3P的相对表达量鉴别原发性肝癌与乙肝肝硬化的ROC曲线

图3 miR127-3P的相对表达量鉴别原发性肝癌与慢性乙型肝炎的ROC曲线

图4 miR127-3P的相对表达量鉴别原发性肝癌与健康对照的ROC曲线

讨 论

miRNA属于非编码RNA，近年来发现其在肝癌的发生发展中起着促进或抑制作用，血液中多种类型的miRNA对于肝癌的早期诊断已经成为研究热点[9]。miR 127基因位于人类染色体14q32.31上，miR127-3P和miR127-5P属于两个成熟的miR127基因前体[10]，既往研究认为，血清miR127-3P在伴有KRAS突变的直肠癌患者[11]存在高表达，国内学者[4]发现乳腺癌患者癌组织和血清中miR127-3P表达均显著上调，且与肿瘤标志物CA153呈显著正相关性(r=0.786，P=0.000)，提示miR127-3P发挥着促癌作用；但蒋华蔚[5]研究发现，miR127-3P在神经胶质母细胞瘤患者癌组织中表达下调，主要与miR127-3P诱导细胞G1期阻滞、抑制原癌基因SKI的激活从而抑制了神经胶质母细胞瘤细胞的增生；Wang D等[12]发现，miR127-3P能通过抑制ITGA6基因从而抑制骨肉瘤细胞的增殖与转移，故而miR127-3P对肿瘤起到促进或抑制作用存在差异。目前为止，关于肝癌患者血清中miR127-3P的表达是否存在异常及能否作为肝癌的血清学标志物现尚不清楚，本研究通过对95例肝癌患者的外周血miR127-3P进行检测后发现，肝癌患者血清中miR 127-3P表达上调，且相对表达量显著高于乙肝肝硬化及慢性乙型肝炎患者，同时与AFP呈现显著正相关性，考虑miR127-3P可能作为肝癌的血清学标志之一。为进一步明确miR127-3P诊断肝癌的临床效能，我们采用ROC曲线分析后发现，miR127-3P在鉴别肝癌和乙肝肝硬化的临床效能较高，曲线下面积为0.829(95%CI：0.755～0.903)，当截断值为0.535时，敏感度和特异度分别为68.4%和94.3%，这提示我们检测miR127-3P的表达对乙肝肝硬化患者是否进展到肝癌具有指导意义，同时miR127-3P也可作为肝癌的一个血清学标志物。进一步通过logistic回归分析miR127-3P相对表达量的影响因素结果发现，当肝癌患者的分化程度越低、TNM分期越高及存在远处转移时均是miR127-3P相对表达量上调的危险因素，这也进一步验证miR127-3P与肿瘤的发生及转移可能有关。

综上所述，肝癌患者血清中miR127-3P表达显著上调，可作为肝癌的一个血清学指标，且与肿瘤的转移具有一定联系，这也为miR127-3P将来是否可以作为肝癌治疗的一个作用靶点提供思路。但本研究的局限性在于未探讨miR127-3P促进肝癌发生发展中的具体作用机制，同时肝癌患者癌组织中miR127-3P的表达量是否上调仍值得以后进一步探讨。