CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信号通路在莱姆病发病机制中的作用

陆丽红,丁 喆,简苗苗,计震华,宝福凯*,柳爱华*

(昆明医科大学a.第二临床学院; b.云南省高校热带传染病重点实验室; c.热带医学研究所; d.病原生物学与免疫学系;e.生物化学与分子生物学系,中国云南 昆明 650500)

莱姆病(Lyme disease,LD)又称莱姆包柔体病(Lyme borreliosis),是由蜱传播的一种自然免疫源性感染性疾病,伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi,Bb)为致病源[1～2]。我国于 1985年首次在黑龙江省林区发现本病病例,现分布范围已遍及中国大部分地区,至少累及30 个省份[3]。莱姆病系全身性感染,可导致多系统多脏器损伤[4],临床表现较复杂,一般潜伏期为3～32 d,平均7 d,临床症状分为一、二、三期,一期表现为皮肤慢性游走性红斑,可伴有乏力、畏寒发热、恶心呕吐和脑膜刺激征等临床症状; 二期时8%～15%的患者出现神经系统症状和心脏受累的现象; 三期时80%的患者出现不同程度的关节症状[5]。莱姆病的致死率和致残率逐年上升,但其发病机制仍不清晰。近年来,人们在探索CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信号通路各部分介导伯氏疏螺旋体引发的炎症反应、内化及宿主细胞凋亡方面取得了很大进展,为莱姆病的发病机制研究提供了重要启示。

1 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信号通路概述

伯氏疏螺旋体入侵机体后,CD14 识别病原体表面的细菌脂蛋白(bacterial lipoprotein,BLP),二者形成稳定的复合物[6]。该复合物与Toll 样受体2 (Toll-like receptor 2,TLR2)结合后引起 TLR1 和TLR2 的二聚化,同时可引起二聚体的构像变化,使得TLR1 和TLR2 的TIR 结构域更加靠近[7]。TLR1和TLR2 通过脂蛋白N-端的半胱氨酸识别三酰化的脂蛋白[8]。TLR1-TLR2 的配体激活髓样初级反应基因88 (myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)依赖通路[9],其中TLR2 通过BB-loop 和poc 位点募集下游接头分子MyD88,完成TLR2 的TIR 结构域与MyD88 的TIR 结构域的二聚化[10]。但有研究表明TLR1-TLR2 除激活MyD88外,也激活了TRIF(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β),激活的 TRIF 可介导TLR1-TLR2 信号来合成配体,如 Pam3CSK4[11]。TRIF 和MyD88 相互作用,引起下游信号转导,其中Petnicki-Ocwieja 等[11]证明TRIF 诱导促炎因子需要MyD88 的存在,但其相关机制尚不明确。在巨噬细胞中CD14、TLR1-TLR2 和吞噬细胞受体形成脂筏[12],导致原本结合在MyD88 调节蛋白Toll 互作蛋白(Toll-interacting protein,Tollip)上的MyD88的下游激酶——白介素1 受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)从结合体上脱落,同时完成IRAK 的自动磷酸化[13]。MyD88的 C 端 Toll/IL-1 受体(Toll/IL-1 receptor,TIR)结构域与受体结合,N 端的DD 结构域募集IRAK1 和IRAK4,募集的IRAK4 发挥激酶作用导致IRAK1磷酸化[14]。活化后的IRAK1 进一步募集肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumour necrosis factor-receptorassociated factor-6,TRAF6)并使其寡聚化。IRAK1与TRAF6 随后与转化生长因子β 活化激酶 1(transforming growth factor beta-activated kinase-1,TAK1)、TAK1 结合蛋白 1(TAK1-binding protein-1,TAB1)和TAB2 形成一个复合体。复合体包含了泛素结合酶13(ubiquitin-conjugating enzyme-13,Ub-C13)和泛素结合酶E2 变体-1A (ubiquitin-conjugating enzyme E2-variant-1A,UEV1A)[15],介导了TRAF6 的泛素化。泛素化的TRAF6 通过与Toll途径进化保守信号中介分子(evolutionarily conserved signaling intermediate,ECSIT)相互作用激活TAK1。TAK1 通过激活丝裂原活化蛋白激酶激酶3 (mitogen-activated protein kinase kinase-3,MKK3)和MKK6 使p38 磷酸化。磷酸化的p38 促进吞噬体的形成,激活下游激酶,引起细胞核因子κB (nu clear factor-κB,NF-κB)的核易位,稳定促炎细胞因子的mRNA,使促炎因子表达增加[12](图1)。

2 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信号通路与莱姆病相关炎症

由于缺乏脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),细菌脂蛋白(BLP)被认为是介导伯氏疏螺旋体的主要炎症反应介质[16]。伯氏疏螺旋体的脂蛋白是一种膜锚定蛋白,由脂蛋白前体经脂质化修饰而成,并经由Lol (localization of lipoproteins)系统从细胞周质运输到细胞外膜上[8]。BLP 被认为是炎症的主要诱导因子,作为TLR2 配体的同时也是一种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),并且在极低的浓度下也能被TLR2识别。CD14 可识别伯氏疏螺旋体表面的脂蛋白,从而激活CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 通路,诱导促炎因子分泌,引起机体的炎症反应。

2.1 CD14与莱姆病相关炎症

CD14 的编码基因位于人的第5 号染色体长臂端5q23～q31,约含有1 338 个核苷酸残基,编码含有375 个氨基酸的糖蛋白,该糖蛋白的相对分子质量为55 kD,主要特征结构为N-末端富含亮氨酸的重复单位(leucine-rich repeats,LRRs)[17]。CD14 分为 mCD14 和 sCD14,mCD14 主要分布在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的表面,sCD14则存在于正常人和动物的血浆中,二者的区别在于 sCD14 较 mCD14 缺少 GPI 螯合物[18]。CD14 作为一种连接受体[19],主要的生物学功能是识别、结合LPS 或LPS/LBP 复合物,介导LPS 所致的细胞反应,其在炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。在莱姆病中,CD14 介导的MAPK 通路在促炎抗炎微环境的调控中扮演了重要角色,参与了螺旋体刺激巨噬细胞后白介素10 (interleukin-10,IL-10)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)的生成[20]。CD14 可在多种损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)作用下促进炎性细胞分泌促炎因子。研究报道,缺少CD14 的细胞在DAMPs 的作用下表现出低反应的特性,下游信号如p38 MAPK 等均不能被激活,导致病原体入侵机体时机体分泌更多的促炎因子,从而表现出更严重的炎症反应[12]。此外,在莱姆关节炎中,CD14 的缺乏会导致基质金属蛋白酶9 的活化减少,胶原蛋白降解减少,杀灭螺旋体的中性粒细胞募集受阻,最终使莱姆关节炎加重[21]。由此可见,CD14 在机体炎症反应中发挥着重要作用。

图1 细菌脂蛋白介导的CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信号通路Fig.1 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK signaling pathway mediated by bacterial lipoproteins

2.2 TLR1/TLR2与莱姆病相关炎症

TLRs 是表达于天然免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞等细胞表面的重要模式识别受体,通过自身的LRRs 结构域识别PAMPs,刺激炎症因子的生成,参与病原体的杀伤[10]。TLR1 和TLR2 分布于细胞膜表面,参与识别病原体表面的脂蛋白、鞭毛和脂肽等成分。和TLRs 家族其他成员相同,TLR1 和TLR2 含有胞内保守的TIR 结构域,用于与下游接头分子的TIR 功能域特异性相互作用。但是,TLR2 的激活常需要TLR1 和TLR6 的参与,且TLR2 需与TLR1 和TLR6 分别结合形成异二聚体[22]。TLR1 中保留了与TLR2 结合的二聚体界面和脂肽通道,TLR2 和TLR1 以αE 螺旋的FW残基为关键位点[10],通过螺线管结合形成异质二聚体[22]。除 αE 螺旋的 FW 残基外,BB-loop 和 DD-loop 也是TLR1 和TLR2 异源二聚化的重要功能域[10]。TLR2 之所以能够识别细菌、真菌和原生生物等不同微生物的外膜成分,TLR1 在其中扮演着重要角色。TLR1 具有一个疏水性通道,对于TLR1 和TLR2 形成异二聚体识别三酰化的脂蛋白有着重要作用。相关结构研究表明,三酰化的脂肽类似于革兰氏阴性杆菌的脂蛋白,且TLR1/TLR2 一般只能够识别三酰化的脂蛋白[7,23]。伯氏疏螺旋体表面的脂蛋白主要由TLR1-TLR2 识别[24],识别后可引起下游炎症信号的激活,并使机体产生促炎因子。在树突状细胞中,TLR1-TLR2 识别伯氏疏螺旋体后激活MyD88 依赖的NF-κB 信号级联反应,导致树突状细胞的成熟和迁移; 树突状细胞作为一种专职抗原提呈细胞(APC),将伯氏疏螺旋体提呈给CD4+T 细胞,促进促炎因子生成[25]。相关研究报道,在敲除了TLR2 的小鼠莱姆关节炎模型中CD4+T 细胞并未发生增殖,而CD8+T细胞发生了增殖; 同时,CD8+T 细胞可以刺激滑膜细胞产生CXCL9,加速炎症进程[24]。另有研究报道,在敲除IL-10 的小鼠中,TLR2 可以激活CD4+T细胞和 CD8+T 细胞,促进干扰素-γ (interferon-γ,IFN-γ)的产生,而伯氏疏螺旋体的入侵也可促进CD4+T 细胞和CD8+T 细胞的增殖,并在感染3周后细胞数量达到峰值。此外,在伯氏疏螺旋体感染后,TLR2的转录特异性增强,表达量增加,而TLR1、TLR6 等的转录特异性不变[26]。综上所述,CD4+T 细胞和CD8+T 细胞在莱姆关节炎发生中发挥重要作用,而TLR2 则作为T 细胞活化的关键成分参与到炎症的进程中。当用特异性中和抗体阻断TLR1-TLR2 信号通路时,趋化因子CC 和 CXC 家族的分泌受到抑制,这提示可以通过阻断TLR1-TLR2 的激活来抑制机体的炎症反应[27]。

2.3 p38 MAPK与莱姆病相关炎症

p38 作为MAPKs 家族的三大分支之一,通过微调抗炎和促炎信号影响炎症的发生,并且在应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用[28]。p38 是由360 个氨基酸组成的,大小为38 kD 的蛋白质,与JNK 同属应激激活的蛋白激酶。目前存在6 种p38 MAPK 亚型,分别是 p38α1/α2、p38β1/β2、p38γ 和 p38δ,其中 p38α和p38β 几乎在所有的组织细胞中表达[29],但p38γ主要存在于骨骼肌中,p38δ 则多见于睾丸、唾液腺、胰腺、前列腺、小肠、脑垂体等部位,虽然不同亚型其氨基酸的组成个数不同,但同源性超过了50%[30]。p38 MAPK 在莱姆病的发生发展中扮演着重要角色,通过抑制p38 MAPK 可以显著抑制伯氏疏螺旋体与机体作用时促炎因子的生成,从而减轻莱姆病的严重程度。MKK3 是p38 MAPK 的上游激活物,当它被阻断时,p38 MAPK 不能被激活,Th1 细胞反应降低,经p38 MAPK 诱导产生的IFN-γ 减少,莱姆关节炎减轻[31]。然而,当在莱姆心脏炎中阻断MKK3 时,炎症减轻的效果却不如莱姆关节炎中显著,这可能与p38 MAPK 的各种亚型在组织中的分布不均匀,且MKK6 也可以激活p38 MAPK 有关[32]。此外,在神经莱姆病中,p38 MAPK 的受阻也可以抑制少突胶质细胞和巨噬细胞生成促炎因子TNF-α[33]。综上可知,p38 MAPK在莱姆关节炎、莱姆心脏炎以及莱姆神经炎中都起着重要作用。

3 CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK信号通路与伯氏疏螺旋体内化和宿主细胞凋亡

CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信号通路在介导伯氏疏螺旋体引发的炎症反应方面具有重要作用。同样,此通路上的重要组成成分在伯氏疏螺旋体介导的细胞凋亡和内化过程中也具有重要作用。

伯氏疏螺旋体进入人体后可以引起小胶质细胞和少突胶质细胞的凋亡,导致炎症的发生,而该炎症的发生又可引起更多神经元死亡,使机体表现出神经系统的病变; 相关研究认为小胶质细胞在炎症微环境中对神经元的凋亡发挥着不可替代的作用,当受到伯氏疏螺旋体刺激后,小胶质细胞上的TLR2 表达上调,可能通过增加IL-6 的产生来介导细胞凋亡[34～37]。p38 激酶是一种应激激活的激酶,参与调节炎症介质的产生[38],并可通过下游的caspase 来诱导细胞凋亡[30]。在关于伯氏疏螺旋体导致细胞凋亡的研究中,相关报道指出TLR2 也可通过MyD88、Fas 相关死亡结构域蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)/caspase-8 介导与细胞凋亡相关的信号转导[39]。

细胞的内化也被认为是导致莱姆病的一大重要因素。伯氏疏螺旋体的内化经由固有免疫系统细胞的吞噬作用介导[40]。目前认为伯氏疏螺旋体可通过3 种途径进入吞噬细胞,分别是Fcγ 受体介导的吞噬作用、传统的吞噬作用和卷曲吞噬作用[41],其中卷曲作用被认为是伯氏疏螺旋体内化的首选途径[42]。巨噬细胞可以伸出一个长而富含肌动蛋白的丝状伪足包围住伯氏疏螺旋体,且卷曲的伪足有多个弯曲节点,可以灵活地与螺旋体结合,在此过程中细胞肌动蛋白骨架发生重组[43]。当病原体与吞噬细胞表面结合后,肌动蛋白相关蛋白质募集到脂筏表面,进行受体依赖的细胞骨架重排,以此作为伯氏疏螺旋体内化的前奏[12]。许多受体都被证明参与了伯氏疏螺旋体的内化过程,如Fcγ 受体、甘露糖受体、补体受体 3、整合素 αMβ2等[42]。当伯氏疏螺旋体与吞噬细胞结合时,与吞噬有关的基因CD14 表达上调,随后CD14 与整合素的C 型凝集素结构域结合,促进补体受体3 与伯氏疏螺旋体的结合物向细胞表面移动,从而启动内化信号[42,44～45]。整合素是配体内吞的重要调节因子,伯氏疏螺旋体可表达整合素α3β1,并通过脂蛋白的内吞作用激活TLR1-TLR2,随后TLR1-TLR2 的配体Pam3CSK4诱导内吞信号转导,并通过网格蛋白完成内化。与整合素α3β1 不同,整合素 αvβ3 介导 Pam3CSK4与巨噬细胞结合,导致三酰化脂蛋白与TLR1-TLR2 在细胞表面聚集,从而促进细胞内吞信号转导[19]。需要指出的是,伯氏疏螺旋体进入宿主细胞并不完全依赖某一个受体,有学者提出在这些受体激活的下游吞噬通路中可能存在着复杂的交叉作用[42]。

4 结语与展望

综上所述,CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信号通路在莱姆病的发病机制中可能扮演着重要角色。已有研究显示,加入外源性cAMP 能显著增加IL-10 的表达且能显著降低促炎、关节炎易感性基因的转录水平[20]。因此,cAMP 调节剂相关的药物研究或许可以为治疗伯氏疏螺旋体引起的炎症反应打开新思路。此外,蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)的新型抑制剂粗糠柴毒素和白屈菜赤碱可以显著抑制p38 的磷酸化,同时可以显著减轻感染后C3H/HeN 小鼠的踝关节炎和肿胀,并且可以阻断IL-1b 和IL-8 等炎症介质的转录[46],提示含有PKC 抑制剂的药物对伯氏疏螺旋体引起的感染可能具有临床应用价值。

目前,CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK 信号通路与莱姆病相关螺旋体内化、炎症反应和细胞凋亡的关系都有研究,但存在对三者之间的联系研究不够深入的情况。对三者之间的联系进行深入研究将让我们对莱姆病的发病机制有更全面的了解。同时,现有工作注重该信号通路上某一成分的研究,缺少对信号通路的整体研究。完整信号通路的研究将为探索莱姆病发病机制提供新思路,并可为一些靶点药物的开发提供更好的理论依据。